葛根药材中化学成分HPLC指纹图谱研究

黄 芳 祝婧云 梁新丽

(1 张家港市中医医院，苏州，215600； 2 南昌大学第四附属医院，南昌，330004； 3 江西中医药大学，南昌，330004)

葛根药材中化学成分HPLC指纹图谱研究

黄 芳1祝婧云2梁新丽3

(1 张家港市中医医院，苏州，215600； 2 南昌大学第四附属医院，南昌，330004； 3 江西中医药大学，南昌，330004)

目的：探索研究建立葛根高效液相指纹图谱的方法与条件，以更好地控制葛根质量。方法：Agilent1260高效液相色谱仪；kromasil 100-5C18(4.6 mm×250 mm，E63848，25 cm)色谱柱；流动相：A-乙腈；B-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱，流速为1 mL/min,柱温为30 ℃，检测波长为250 nm，探索研究了葛根药材以及提取物指纹图谱。结果：运用梯度洗脱法得到的色谱图各色谱峰分离较好，达到指纹图谱要求，初步建立了葛根的指纹图谱。结论：HPLC指纹图谱法使用方法不同，所得到的图谱结果也会有所不同，可根据最后所得到的理想指纹图谱来断定高效液相的最佳使用条件方法。

葛根药材；HPLC；质量

葛根(Luerariae Lobatae Radix)为豆科植物野葛(PuerarialobataWilld Ohwi)的干燥根，主产于湖南、河南、广东、浙江等地，秋冬季采挖，趁鲜切成厚片或小块，干燥[1]。其被收载于《中华人民共和国药典》各版。葛根性凉，味甘、辛，解肌退热，生津止渴，透疹，升阳止泻，通经活络，解酒毒[1]。各版的药典中规定葛根中的葛根素为该药材质量控制的重要成分，但是鉴于针对中药材或中成药的真正质量和疗效并不能因为某一个有效成分而得到完全保证，故而，目前使用指纹图谱技术已然成为能够被国际公认的控制中药和天然药物质量的最有效的手段[2-7]。结合各版药典中葛根素为其控制的有效成分以及指纹图谱在中药和天然药物质量控制中的作用和地位来开展中药材葛根中化学成分的指纹图谱方法研究。目前，文献报道的有关葛极药材指纹图谱的研究中，大多葛根素成分与其他成分很难分开[8-9]。作者参考相关文献[10-12]，通过实验考察不同洗脱条件下的指纹图谱中各成分的分离情况，来建立中药材葛根高效液相指纹图谱，以作为评价和控制中药葛根原药材内在质量的标准。

1 材料与方法

1.1 实验仪器 色谱仪器为Agilent 1260高效液相色谱仪(自动进样器)，DAD检测器；SHB-III循环式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)。

1.2 药物及试剂 葛根素对照品(中国药品生物制品检测所，批号为101765-200408)，乙腈为色谱纯，水为双蒸水,其他试剂均为分析纯。用于指纹图谱的10批药材葛根饮片购自精华制药亳州康普有限公司(产地安徽霍山县葛根基地)。10样品批号见表1。

表1 样品批号

1.3 研究方法

1.3.1 梯度条件的优化 色谱柱为kromasil 100-5C18(4.6 mm×250 mm，25 cm)；流动相为乙腈-0.1%磷酸水，梯度洗脱；考察乙腈起始浓度、终点浓度及梯度洗脱时间。流速为1.0 mL/min；检测波长为250 nm；柱温为30 ℃，进样量为20 μL[13]。梯度洗脱考察见表2。色谱图见图1～图4。结果表明0～40 min，乙腈浓度由10%～30%梯度洗脱，葛根提取液各色谱峰均能够得到较好的分离，即表2中方法4。

1.3.2 对照品配制 精密称取葛根素对照品适量，用甲醇稀释成每1 mL含100 μg的溶液，作为对照品溶液。

1.3.3 供试品溶液的制备 取各批葛根饮片50 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加加10倍量双蒸水加热回流提取3 h，共提取3次，合并3次提取液，0.45 μm滤膜过滤，取续滤液，即得。

表2 梯度洗脱条件考察

1.3.4 指纹图谱的建立

1.3.4.1 测定方法 分别精密量取葛根素对照品溶液和各供试品溶液20 μL，注入液相色谱仪，按0～40 min，乙腈浓度由10%～30%，0.1%磷酸水由90%～70%梯度洗脱，记录40 min色谱图即得。对照品色谱图见图5，供试品色谱图见图4。以葛根素的色谱峰(s)的保留时间和峰面积为1，计算其他各峰的相对保留时间和相对峰面积比值。

图1 方法1葛根指纹图谱

图2 方法2葛根指纹图谱

图3 方法3葛根指纹图谱

图4 方法4葛根指纹图谱

1.3.4.2 精密度试验 以葛根药材A(批号20141104)为供试品，精密吸取供试品溶液，连续进样6次，测得共有峰11个，各共有峰相对峰面积的RSD均<5%，结果表明精密度良好。

1.3.4.3 重复性试验 取A号样品6份，精密称定，制备供试品溶液，分别进样，测得各共有峰相对峰面积的RSD均<5%，结果表明其重复性较好。

1.3.4.4 稳定性试验 取A号葛根供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12进样，测得共有峰相对峰面积的RSD均<5%，结果表明供试品溶液在12 h内稳定。

表3 10批样品共有指纹峰相对保留时间

表4 10批样品共有指纹峰相对峰面积

图5 A葛根HPLC指纹图谱 B葛根素对照品

2 指纹图谱分析与评价

2.1 共有指纹峰的标定 根据10批供试品溶液HPLC色谱提供的相关参数，比较各批样品的色谱图，其中共有峰11个(图5)。其中5号峰为葛根素的色谱峰。

表5 10批样品共有指纹峰峰面积

2.2 共有指纹峰面积比 共有峰的峰面积、相对保留时间、相对峰面积：5号峰为葛根素，是葛根中的主要有效成分，其峰面积占总峰面积的48.3%，比较稳定，因此，可以以其作为参照峰。共有峰相对保留时间和峰面积见表3、表4、表5。由表3、表4可知10批样品间各共有峰相对保留时间RSD<5%，相对峰面积峰1、2、4、9、10RSD>5%。表5结果表明，共有峰总面积上总峰面积的平均百分数为92.87%，RSD为1.86%,符合批纹图谱的有关规定。

3 讨论

本实验采用的是乙腈-0.1%磷酸梯度洗脱法，能够使葛根中的大部分黄酮类化合物(即中药材葛根的主要有效成分)得到较好的分离[14]，因此得到了较完整的HPLC色谱图。本实验方法精密度和重现性都很好，因此可以用来研究葛根化学成分HPLC指纹图谱法出峰时间以及出峰质量，可以更好地鉴别野葛的各种品种的真伪和各种不同产地，不同类别葛根药材的内在质量的优劣。

从指纹图谱看，方法1和方法2出峰时间快，但色谱图中很多峰未能较好的分离。方法3出峰时间也较短，出峰质量较之方法1和方法2有了提高，但方法3中葛根素峰与其他峰未较好的分离。方法4出峰质量最好，很清晰，能够将各个峰很好地分离，对于葛根质量的控制有很大的保证。

本实验探讨研究应用不同的方法，来获得中药材的指纹图谱，探究了更加简便、更加可靠，可以用于大力推广的正确方法。为以后的实际运用提供切实可靠易行的参考方法。

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(2016-05-19收稿 责任编辑：张文婷)

Study on HPLC Fingerprint Analysis on Chemical Composition of Radix Puerariae

Huang Fang1, Zhu Jingyun2, Liang Xinli3

(1TraditionalChineseMedicineHospitalofZhangjiagang,Zhangjiagang215600,China; 2ThefourthAffiliatedHospitalofNanchanguniversity,Nanchang330004,China; 3KeyLaboratoryofModernPreparationofTCMofMinistryofEducation,JiangxiUniversityofTCM,Nanchang330004,China)

Objective:To study the method and condition for HPLC fingerprinting of Radix Puerariae, in order to better control the quality of herbal medicine. Methods:Agilent 1260 by high performance liquid chromatograph was applied and kromasil 100-5C18(4.6 mmx250 mm, E63848, 25 cm) chromatographic column was established. The mobile phase was A-acetonitrile and B-0.1% phosphoric acid aqueous solution with gradient elution and velocity was set as 1 mL/min with the column temperature for 30 ℃. The detection wavelength was 250 nm to explore and study Radix Puerariae extracts of medicinal herbs as well as fingerprints. Results:Separation in each chromatographic peak of obtained chromatogram by the above method was great, meeting the requirements to fingerprints. The fingerprint for Radix Puerariae was preliminary established. Conclusion:As different HPLC fingerprint methods are applied, the map results will vary. The optimal use and ideal conditions of high performance liquid chromatography method can be summarized based on the result of the best fingerprints.

Radix Puerariae; HPLC; Quality

国家自然科学基金青年基金项目(编号：81303237)——白芷促进P-gp介导活性成分吸收的物质基础及机理研究

黄芳(1977.11—)，女，本科，主管中药师，研究方向：药剂学研究工作，E-mail:huangfang@126.com

祝婧云(1986.11—)，女，硕士，主管中药师，研究方向：药剂学研究工作，E-mail:paln7@163.com

R284.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.12.069