不同胚胎冷冻方法对人类早期胚胎解冻后的复苏效果及临床结局的影响▲

王星星 江 莉 毛文琪 张季阳 翟丹梅 杭 馥 陆 丹

(广西医科大学第一附属医院生殖中心，南宁市 530021，E-mail：415050178@qq.com)

不同胚胎冷冻方法对人类早期胚胎解冻后的复苏效果及临床结局的影响▲

王星星 江 莉 毛文琪 张季阳 翟丹梅 杭 馥 陆 丹

(广西医科大学第一附属医院生殖中心，南宁市 530021，E-mail：415050178@qq.com)

目的 比较玻璃化冷冻与程序化冷冻对人类早期胚胎解冻后复苏效果及临床结局的影响。方法 辅助生殖技术获取的剩余可利用人类胚胎2 884枚，其中采用玻璃化冷冻复苏666个周期，解冻胚胎1 516枚、复苏1 383枚、移植胚胎1 375枚；程序化冷冻复苏506个周期，解冻胚胎1 368枚、复苏1 090枚、移植1 077枚。比较两种方法的复苏效果及临床结局。结果 玻璃化冷冻组胚胎复苏率、胚胎完整率分别为92.02%、92.11%，高于程序化冷冻组的79.68%、69.63%(P<0.05)；两组种植率、临床妊娠率、周期取消率、多胎妊娠率、早期流产率、新生儿胎龄、早产率、新生儿出生体重、出生缺陷率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 玻璃化冷冻较程序化冷冻有更高的胚胎复苏率及胚胎完整率，胚胎利用率高，两种冷冻方法的临床结局相似，适用于人类胚胎的冷冻。

胚胎冷冻；玻璃化冷冻；程序化冷冻；胚胎移植；妊娠结局；复苏

在人类辅助生殖技术中，胚胎冷冻技术旨在经过冷冻和复苏后，胚胎仍能保持原有的生物学活性。胚胎冷冻技术提高了每一卵巢刺激周期累积妊娠率，减少多胎妊娠率，预防卵巢过度刺激综合征。目前临床上常用的胚胎冷冻技术有程序化冷冻及玻璃化冷冻。程序化冷冻临床应用时间长，对设备要求严格，需要较长操作时间。玻璃化冷冻法具有操作简单、节省时间、避免冰晶损伤细胞等优势，而该技术在人类胚胎应用时间较短，随访数据较少。本研究回顾性分析我院中心实施胚胎冷冻复苏的患者的临床资料，比较程序化冷冻与玻璃化冷冻对胚胎的冷冻复苏效果、临床结局及新生儿情况的影响。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2014年1～12月在我院生殖中心实施冷冻胚胎复苏患者的临床资料，共1 172例患者在我中心采用常规方法进行促排卵、取卵，将所取得的卵子进行体外受精(in vitro fertilization，IVF)或卵母细胞胞质内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)，常规培养观察，根据临床需要选择胚胎移植，移植胚胎数≤3枚。将剩余可利用的胚胎共2 884枚进行程序化冷冻或玻璃化冷冻保存，或经囊胚培养后行玻璃化冷冻保存。排除宫腔形态异常、子宫内膜异位症、子宫肌瘤、多囊卵巢综合征患者及其可能影响胚胎着床的因素。

1.2 方法

1.2.1 胚胎冷冻及复苏方法：(1)程序化冷冻：采用Quinn′s试剂盒(美国)，使用Planner程序冷冻仪进行冷冻，按文献[1]中的程序化冷冻方法进行操作：将胚胎依次转入由磷酸盐缓冲液、丙二醇及蔗糖组成的冷冻保护剂(F1液、F2液、F3液)，其中置入F1液、F2液中各10 min，后转入F3液，装入麦管，将麦管置于程序冷冻仪依设定程序逐步降温和人工植冰，于-130℃转入液氮罐。复苏方法：从液氮罐中取出麦管，室温40 s，然后迅速放至30℃水浴中20 s，剪去麦管底部，将胚胎推注于由磷酸盐缓冲液、丙二醇及蔗糖组成的解冻液(T1液、T2液、T3液、T4液)中，先于T1液中5 min，再依次移入T2液、T3液中各5 min，最后移入T4液5～10 min，最后移入过夜平衡的培养液(美国)中。(2)玻璃化冷冻：采用Medicult玻璃化冷冻试剂盒行玻璃化冷冻。由二甲基亚砜、乙二醇和蔗糖组成冷冻保护剂(包括BS液、ES液、VS液)，将胚胎依次移入BS液、ES液、VS液，分别停留1 min、6 min、30 s，最后将胚胎用冷冻载杆装载，直接投入液氮冻存。复苏方法：将冷冻载杆从液氮中取出后迅速插入由二甲基亚砜、乙二醇和蔗糖组成的解冻液(V1液、V2液、V3液、V4液)中，先置于V1液中，37℃温台上保持1 min，待冷冻小球融化后，依次移入V2液、V3液中，在室温下保持各3 min，再移入V4液中室温保持 3 min，充分洗涤胚胎后在37℃温台保持3 min，最后移入过夜平衡的培养液(SAGE，美国)中。囊胚期胚胎冷冻前采用激光皱缩处理，应用激光穿透透明带，释放囊内液以皱缩囊胚，应远离内细胞团。

1.2.2 胚胎分级及胚胎复苏标准：IVF或ICSI后16～18 h起连续评估原核评分、早期卵裂、卵裂期胚胎评分，获卵后第3天进行胚胎分级。胚胎碎片分级[2]：Ⅰ级为胚胎无碎片；Ⅱ级为胚胎碎片<20%；Ⅲ级为胚胎碎片在20%～50%；Ⅳ级为胚胎碎片>50%。囊胚期胚胎分级按人类囊胚分级系统(Gardner法)评分[3]。以解冻后胚胎复苏的卵裂球细胞数≥50%总细胞数作为胚胎复苏的标准。胚胎完整率=复苏后卵裂球完整存活的胚胎数/存活胚胎数×100%。

1.2.3 移植子宫内膜准备方案：按照患者有无规律月经周期选择子宫内膜准备方案。月经周期规律、排卵正常者采用自然周期；月经不规则和(或)无自发排卵者采用人工周期。

1.2.4 胚胎移植方法：患者仰卧位，消毒外阴，铺巾，使用窥器暴露宫颈，棉签清除宫颈黏液，在B超引导下将胚胎经由胚胎移植管缓慢注入宫腔距宫底1～2 cm处，缓慢退出移植管并在显微镜下观察是否有胚胎漏出及宫腔出血。移植后继续肌注黄体酮行黄体支持。

1.2.5 移植后管理及随访：移植14 d后检测血绒毛膜促性激素，了解是否妊娠，未妊娠则停止黄体支持，如为生化妊娠继续黄体支持。移植后4周行B超检查，见宫内妊娠囊为临床妊娠。所有孕妇于孕中期、分娩时、分娩后1～2个月进行随访，随访内容包括：孕产期并发症、新生儿胎龄、性别、出生体重及出生缺陷等。

1.3 统计学分析 应用SPSS 16.0统计学软件进行数据处理，计数资料采用χ2检验或Fisher确切概率法，计量资料以(x±s)表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 患者临床资料及妊娠结局 总共收集冻融胚胎移植1 172个周期。其中玻璃化冷冻复苏666个周期，解冻胚胎1 516枚、复苏1 383枚、移植胚胎1 375枚；程序化冷冻复苏506个周期，解冻胚胎1 368枚、复苏1 090枚、移植1 077枚。两组的患者年龄、移植日子宫内膜厚度比较，差异无统计学意义(P>0.05)。玻璃化冷冻组胚胎复苏率、胚胎完整率高于程序化冷冻组，移植胚胎数少于程序化冷冻组(P<0.01)，两组种植率、临床妊娠率、多胎妊娠率、早期流产率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。3胎妊娠共有3例，3例均行减胎术；其中程序化冷冻组2例，玻璃化冷冻组有1例双胎妊娠，孕早期B超显示有其中一胎儿脑膨出畸形行减胎术，另一胎儿分娩后未见出生缺陷。

表1 两组的临床资料、胚胎发育及其临床结局

2.2 玻璃化冷冻卵裂期胚胎及囊胚期胚胎妊娠结局的比较 玻璃化冻融移植的658个周期中，卵裂期胚胎周期606个，囊胚期胚胎周期52个。囊胚期的胚胎复苏率、胚胎种植率、临床妊娠率均高于卵裂期(P<0.05)，见表2。囊胚期组新生儿未见有出生缺陷。

表2 玻璃化冷冻人囊胚期和卵裂期胚胎的发育情况及临床结局(x±s)

2.3 两种冷冻方法的新生儿情况 玻璃化冷冻组分娩新生儿175人，程序化冷冻组分娩新生儿139人，程序化冷冻组中1例新生儿因“膈疝”抢救无效死亡。玻璃化冷冻出现1例先天性心脏病合并Ⅰ°唇裂、足外翻；程序化冷冻出现胎儿脑积水合并侧脑室增宽1例，新生儿膈疝1例；两组新生儿胎龄、出生体重、早产率、出生缺陷率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 新生儿情况(x±s)

注：*Fisher确切概率法。

3 讨 论

随着人类辅助生殖技术的发展，人类胚胎冷冻保存技术成为其中一个重要组成部分。该技术最大意义是提高了每一卵巢刺激周期累积妊娠率，将剩余胚胎或周期不适宜移植的胚胎冻存，提高了胚胎利用率，以便于根据患者实际情况选择合适移植时机。玻璃化冷冻法的胚胎复苏率比程序化冷冻高，操作灵活度高、耗时短，不严格依赖于昂贵的程序化冷冻仪，目前在大多数中心均以玻璃化冷冻为主。但各中心关于玻璃化冷冻对胚胎发育及妊娠结局影响的结论不尽相同。

Sifer[4]的研究结果显示，玻璃化冷冻法组的复苏率、临床妊娠率均显著高于程序化冷冻组，且玻璃化冻融囊胚完整胚胎存活率显著高于程序化冷冻组(P<0.05)。另有研究表明玻璃化冷冻组胚胎复苏率、种植率、临床妊娠率均显著高于程序化冷冻组(P<0.05)[5-6]。也有研究显示玻璃化冷冻D3卵裂期胚胎能显著提高胚胎存活率，但不能显著改善临床妊娠率和胚胎种植率[7-8]。Zhu等[9]的大样本量回顾性分析结果与上述结果相似，且两组的流产率、活产率、新生儿体重无差异。本研究结果也显示，玻璃化冷冻组种植率、临床妊娠率与程序化冷冻组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，两组的早期流产率、新生儿出生体重比较，差异也无统计学意义(P>0.05)。胚胎冷冻复苏过程中产生的冰晶是最重要的冷冻损伤，冰晶对细胞的机械性损伤会对细胞造成致命性损伤甚至死亡。而玻璃化是液态物质在一定的降温速率下由液相直接转变为玻璃状固态的过程，内部没有晶体结构，因而避免了冷冻过程中冰晶对胚胎的损伤，这也是本研究中玻璃化冷冻组胚胎复苏率及胚胎完整率显著高于程序化冷冻组的原因之一。玻璃化冷冻过程中胚胎接触了更高浓度的冷冻保护剂，安全性受到质疑。但本研究中两组新生儿胎龄、早产率、新生儿出生体重、出生缺陷率均无差异；其中玻璃化冷冻组的出生缺陷率为0.57%，低于自然妊娠人群的1.3%[10]。

近年来玻璃化冷冻方法提高了囊胚冷冻的复苏率。本研究中玻璃化冷冻法囊胚期胚胎的复苏率、种植率、临床妊娠率均显著高于卵裂期胚胎(P<0.05)，与赵芳等[11]的研究结果相似。Adler等[12]报告囊胚期胚胎的整倍体率高于卵裂期胚胎。囊胚培养的筛选作用淘汰了发育能力异常的胚胎，移植时其内膜与胚胎发育更为同步，而且囊胚细胞数目多，损伤后细胞修复能力强，少数细胞死亡对胚胎发育能力影响小。

综上所述，玻璃化冷冻方法较程序化冷冻方法可获得更高的胚胎复苏率及胚胎完整率，移植胚胎少，胚胎利用率高，能够取得同样的临床结局，适用于人类胚胎的冷冻。玻璃化冷冻囊胚期胚胎较卵裂期胚胎有更好的胚胎复苏率及临床结局。但玻璃化冷冻应用于临床时间较短，尚需对出生后婴幼儿进行长期随访，评估其安全性。

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Eefects of different embryo cryopreservation technologies on recovery efficacy and clinical outcome of human early embryos after unfreezing

WANGXing-xing,JIANGLi,MAOWen-qi,ZHANGJi-yang,ZHAIDan-mei,HANGFu,LUDan

(ReproductiveCenter,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To compare the effects between vitrification and programmable freezing on recovery efficacy and clinical outcome of human early embryos after unfreezing.Methods A total of residual and available 2 884 embryos were obtained using assisted reproductive technology.In 666 vitrification cycles,unfreezing was conducted in 1 516 embryos,recovery in 1 383 embryos,and embryo transplantation in 1 375 embryos.In 506 programmable freezing cycles,unfreezing was conducted in 1 368 embryos,recovery in 1 090 embryos,and embryo transplantation in 1 077 embryos.The recovery efficacy and clinical outcome were compared between the two technologies.Results The embryo recovery rate(92.02%) and embryo integrity rate(92.11%) in the vitrification group were higher than those in the programmable freezing group(79.68% and 69.63% respectively)(P<0.05).There were no statistical differences in the implanted rate,clinical pregnancy rate,cycle cancellation rate,multiple pregnancy rate,early abortion rate,neonatal gestational age,preterm birth rate,neonatal weight at birth or birth defects rate between the two groups(P>0.05).Conclusion Compared to programmable freezing,vitrification can obtain higher embryo recovery rate,embryo integrity rate and utilization rate for embryo.The clinical outcomes of both technologies are similar,and can be applied to human embryo cryopreservation. 【Key words】 Embryo cryopreservation,Vitrification,Programmable freezing,Embryo transplantation,Clinical outcome,Recovery

广西自然科学基金(2013GXNSFAA019140)

王星星(1989～)，女，在读硕士研究生，研究方向：生殖医学基础与临床研究。

江莉(1972～)，女，博士，教授，研究方向：生殖医学基础与临床研究，E-mail：jiangligx2013@163.com。

R 711.6

A

0253-4304(2016)02-0175-03

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.02.08

2015-11-18

2016-01-25)