牦牛源牛链球菌的分离鉴定及部分生物学特性研究

张兴民，张焕容，汤 承，诸明欣

（西南民族大学生命科学与技术学院，成都610041）

牦牛源牛链球菌的分离鉴定及部分生物学特性研究

张兴民，张焕容＊，汤 承，诸明欣

（西南民族大学生命科学与技术学院，成都610041）

摘 要：本研究旨在从腹泻牦牛粪便中分离鉴定牛链球菌，并分析其溶血性、对小鼠的致病性及对抗菌药物的敏感性。将川西北阿坝州45份腹泻牦牛粪便于血平板上划线，37℃、5%CO2培养24h分离细菌，经16SrRNA序列扩增测序和系统发育分析鉴定出14株牛链球菌，其中8株巴黎链球菌，6株解没食子酸链球菌巴氏亚种；9株呈α溶血，5株呈β溶血。分离鉴定的牦牛源巴黎链球菌和解没食子酸链球菌巴氏亚种能引起试验小鼠的轻度腹泻；药敏试验结果显示分离菌株对青霉素、头孢噻肟、万古霉素、乙酰螺旋霉素、环丙沙星、利福平、替考拉宁、氨苄西林和庆大霉素共9种抗生素高度敏感，对链霉素、卡那霉素、林可霉素、红霉素、四环素和克林霉素耐药率较高。本研究阐明了牦牛源链球菌的部分生物学特性，为该病的防控奠定了基础。

关键词：牦牛；牛链球菌；分离鉴定；耐药性

牦牛是中国青藏高原特有的牛科中的独立物种，一般生活在2 500m以上的高寒地区［1］，牦牛腹泻是危害牦牛健康的主要疾病之一，细菌、病毒、寄生虫等病原感染是主要原因［2］。链球菌是化脓性球菌中的一种常见细菌，分布十分广泛，该菌呈圆形或卵圆形，多呈链状排列，可分为α型、β型和γ型3种溶血类型，可感染人和多种动物，并引起一定的病理变化［3－4］。牛链球菌是动物消化道内的正常菌群，常见于牛的胃肠道和粪便，也可从犬、大熊猫、羊和人的胃肠道和粪便中分离到［5－10］。一直以来，牛链球菌被认为是一种无害的细菌，但1945年，Mc－Neal和Blevins首次报道牛链球菌可引起感染性心内膜炎，1951年，McCoy又第一次提出D群链球菌与感染性心内膜炎及结肠癌之间存在相关性，且这种相关性也被随后的研究证实，据报道，牛链球菌可引起鸽子败血症，造成鸽子不能飞行，食欲减退，消瘦，多尿，产生绿色黏液性排泄物甚至急性死亡［11］。因此，人们日益认识到牛链球菌的危害，并展开深入研究。

根据牛链球菌能否发酵甘露醇将其分为2个生物型，能发酵甘露醇的菌株称生物Ⅰ型，不能发酵甘露醇的菌株称生物Ⅱ型。1990年，Osawa研究表明牛链球菌生物Ⅰ型能将产生的单宁酶脱羧为没食子酸，因此，称牛链球菌生物Ⅰ型菌株为解没食子酸链球菌。牛链球菌生物Ⅱ型又分为生物Ⅱ／1和生物Ⅱ／2。生物Ⅱ／1包括甘露醇和β－葡糖苷酸酶阴性、α－半乳糖苷酶阳性的菌株。生物Ⅱ／2包括甘露醇阴性、β－葡糖苷酸酶和β－甘露糖苷酶阳性的菌株。根据生化特性及16SrRNA测序的差异可将牛链球菌分为6个亚种：解没食子酸链球菌解没食子酸亚种、解没食子酸链球菌巴氏亚种、解没食子酸链球菌马其顿亚种、婴儿链球菌婴儿亚种、婴儿链球菌结肠亚种（巴黎链球菌）及不解乳链球菌［12］。目前，对牦牛源牛链球菌的研究较少。本研究从腹泻牦牛粪便中分离鉴定牛链球菌，并对其溶血性、致病性和耐药性进行检测。

1 材料与方法

1.1样品来源

2015年6月初采自四川阿坝州的1～2月龄腹泻牦犊牛粪便样品45份，干冰运输至实验室。

1.2主要试剂和试验动物

绵羊血琼脂平板购自广东环凯微生物科技有限公司；TaqDNA聚合酶、dNTP、DL2000DNA Marker均购自TaKaRa公司；青霉素、氨苄青霉素、头孢噻肟、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、红霉素、螺旋霉素、林可霉素、克林霉素、环丙沙星、利福平、万古霉素、替考拉宁和四环素共15种药敏片均购自杭州微生物试剂有限公司；MH药敏琼脂、胰蛋白胨大豆胨琼脂（TSA）和胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）均购自青岛海博生物技术有限公司。18～22g昆明小鼠购自四川达硕实验动物中心。

1.3细菌的分离纯化

取约1g粪便样品用无菌生理盐水稀释至1mL，充分震荡混匀后取200μL混悬液经划线法无菌接种于绵羊血琼脂平板，置37℃、5%CO2培养24h，观察菌落形态，挑取单个菌落纯化培养。挑取可疑单菌落进行革兰氏染色镜检，在显微镜下观察细菌的染色情况及细菌形态。

1.4加热法提取细菌DNA

参照王琼等［13］取培养16h的TSB含菌培养液1mL于1.5mL EP管中，12 000r／min离心2min，弃上清液。加入500μL TE缓冲溶液充分洗涤菌体，离心弃上清；加入1mL TE缓冲溶液重悬菌体，涡旋使菌体充分混匀，将悬液分装于200μL的PCR管中，用微波炉加热60s，12 000r／min离心2min，取上层液即为提取的细菌DNA，－20℃保存。

1.5分离菌PCR扩增鉴定

采用革兰氏阳性菌16SrRNA基因通用引物［14］PCR扩增16SrRNA序列并测序鉴定，采用链球菌特异性引物PCR扩增鉴定分离菌。引物信息见表1。引物均由成都擎科生物工程有限公司合成。

PCR反应体系25μL：DNA模板2μL，上、下游引物各1μL，10×PCR Buffer 2.5μL，2.5mmol／L dNTP 2μL，ExTaqDNA聚合酶（5U／μL）0.2μL，ddH2O补足体系。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃延伸10min，16℃暂存。PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳观察，并对PCR产物纯化回收，送成都擎科生物工程有限公司测序。

1.6系统发育树的构建

用BLAST软件将测序获得的细菌16SrRNA序列同GenBank数据库中收录的8株牛链球菌（表2）序列进行同源性比对分析，并从GenBank中下载序列相似性最大的其他动物或植物来源的同种细菌的16SrRNA序列，运用Mega 5.1软件构建系统发育树。

表2　参考菌株信息表Table 2 Essential information of reference strains

1.7溶血试验

将纯化后的菌株接种于血平板，置于37℃、5% CO2培养箱中培养24h，观察细菌生长情况及溶血特性。

1.8致病性试验

取分离鉴定的菌株各1株培养后，用TSB培养基培养并调整菌液浓度至1×109CFU／mL，15只18～22g昆明小鼠随机分成3组，每组5只，其中1个对照组，2个试验组，试验组每只小鼠灌服0.2mL菌液，对照组每只小鼠灌服0.2mL TSB培养基，观察小鼠的临床表现，若有发病小鼠，剖检观察小鼠的病变情况。

1.9药敏试验

参照美国临床实验室标准化委员会标准，采用K－B纸片法做药敏试验，检测分离菌对临床常用药物的敏感性。取0.5麦氏单位菌液（含菌量为1× 105～2×105CFU／mL）500μL均匀涂布于含5%犊牛血清的MH药敏琼脂平板上，贴上药敏片，37℃恒温培养18h后测定抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1细菌的分离鉴定结果

45份腹泻牦牛粪便中共分离到31株革兰氏阳性且呈链状排列的细菌，呈圆形或卵圆形（图1）。分离菌在TSA培养基上37℃、5%CO2培养24h可见灰白色、圆形、中央隆起、边缘整齐、表面光滑的中等大小菌落（图2）。分离菌与牛链球菌菌落形态相似。

2.2分离菌16SrRNA序列PCR扩增和测序鉴定

从31株分离菌中均扩增获得了长度约为1 500bp的片段，经测序分析，其中14株与Gen－Bank中牛链球菌（Streptococcusbovis）的同源性最高，相似性为99.4%～99.8%；这14株菌的16SrRNA序列PCR扩增结果与预期扩增片段大小一致（图3）。序列同源性比对结果显示分离的31株细菌中，8株与巴黎链球菌（Streptococcuslutetiensis）的同源性最高，相似性为99.6%～99.8%；6株与解没食子酸链球菌巴氏亚种（Streptococcus gallolyticus）的同源性最高，相似性为99.4%～99.8%。

2.3分离菌链球菌特异性片段PCR扩增鉴定

由图4可知，从31株分离菌中均扩增获得了长度约为600bp的链球菌特异性引物扩增片段，与预期扩增片段大小一致。结果表明，分离到的31株细菌均为链球菌。

2.4牛链球菌16SrRNA系统发育分析

本试验鉴定出的14株牛链球菌16SrRNA序列构建的系统发育树和同源性比对结果见图5、6。14株牛链球菌与GenBank数据库收录的8株牛链球菌聚类后分成两个主要分支，菌株代号1、15、30、18、19、17、23和27的8株巴黎链球菌与StreptococcuslutetiensisKU693335.1、StreptococcusequinusKP703862.1、Streptococcussp KU533881.1、Streptococcussp HQ717303.1、StreptococcuslutetiensisKU693335.1聚在一个分支上，亲缘关系较近，同源性高达99.4%～99.8%。而菌株代号6、7、11、21、26和24的6株解没食子酸链球菌巴氏亚种分离株与StreptococcuspasteurianusEF670543.1、StreptococcusmacedonicusLC097080.1、Streptococcussp KU533869.1聚为一支，亲缘关系较近，同源性高达99.4%～99.8%。

图1　革兰氏阳性链球菌（1 000×）Fig.1 Gram－positiveStreptococci（1 000×）

图2　分离菌菌落特征Fig.2 Colony morphology characteristics of the isolates

图3　14株分离菌16SrRNA基因PCR扩增结果Fig.3 16SrRNA PCR amplification products of the 14isolated strains

图4　链球菌特异性片段PCR扩增结果Fig.4 PCR amplification result ofStreptococcusspecific fragment

图5　牛链球菌分离株与GenBank相关菌株的16SrRNA序列系统发育树Fig.5 16SrRNA gene phylogenic tree of the isolatedStreptococcusstrains and the GenBank recordedStreptococcusbovis

2.5 溶血试验结果

14株鉴定为牛链球菌的菌株中有9株呈α溶血，5株呈β溶血。

2.6牛链球菌分离株对小鼠的致病性

小鼠灌服牦牛源巴黎链球菌和解没食子酸链球菌巴氏亚种6h后开始出现精神萎靡，被毛耸立，蜷缩一隅等临床症状，12h后出现轻度的腹泻症状，剖检见小鼠肠壁变薄，肠内有黄色黏液。其余组织或器官未见肉眼可见的病变。结果表明，分离到的巴黎链球菌和解没食子酸链球菌巴氏亚种具有致病性。

2.7牛链球菌分离株药敏试验结果

14株牛链球菌对青霉素、头孢噻肟、万古霉素、乙酰螺旋霉素、环丙沙星、利福平、替考拉宁和氨苄西林共8种抗菌药物100%高度敏感。对庆大霉素和四环素的高敏率分别为86.6%和33.3%。对链霉素、卡那霉素、林可霉素、红霉素和克林霉素的耐药率较高分别达到60.0%、73.3%、66.7%、46.7%和53.3%（表3）。

表3　牛链球菌的药物敏感性结果（%）Table 3 Drug sensitivity results ofStreptococcusbovis

3 讨 论

牛链球菌是人畜共患病病原，食品中牛链球菌的污染率为3%～5%［15］，人类多因食入被该菌污染的食物引起腹泻，心内膜炎和结肠癌等，被普遍认为是引起人结肠炎的主要致病菌。Paritsky等［16］从203名结肠炎患者粪便中分离牛链球菌，49例（27%）患者携带该菌，其次牛链球菌中的巴黎链球菌和解没食子酸链球菌是引起婴儿腹泻的重要病原菌［17］，所以该菌具有重要的公共卫生学意义。

16SrRNA基因是核糖体RNA基因中的一员，具有进化速率慢、序列保守性高的特点，但同时由于各种原因其序列又有一定的突变，具有种属差异，因而广泛用于种属鉴定及分子分型［18］。本研究采用了细菌16SrRNA基因及序列测定对分离菌进行鉴定。从分子水平上进一步证实从45份牦犊牛粪便中分离的14株牛链球菌中8株为牛链球菌中的巴黎链球菌，6株为解没食子酸链球菌巴氏亚种。随机选取巴黎链球菌和解没食子酸链球菌巴氏亚种各1株感染试验小鼠后，引起了小鼠的轻微腹泻。Paiva等［19］从反刍动物胃肠道中分离的巴黎链球菌感染小鼠，也引起小鼠小肠形态的改变。

本研究分离鉴定的14株牦牛源牛链球菌中9株为α溶血，5株为β溶血。通常认为β溶血的细菌为致病菌，α溶血的细菌为条件致病菌。牦牛源牛链球菌的溶血特性提示应注意该类细菌的致病作用及这两种病原菌的潜在危害。

Leclercq等［20］报道，分离自美国患者的46株牛链球菌对青霉素、利福平、万古霉素、替考拉宁、氨苄青霉素高度敏感。本研究中14株分离菌对青霉素、头孢噻肟、万古霉素、乙酰螺旋霉素、环丙沙星、利福平、替考拉宁和氨苄西林8种抗菌药物100%高度敏感，与Leclercq等［20］的报道一致。2014年，Sheng等［21］从患者血液培养物中分离的60株牛链球菌有38株对卡那霉素和克林霉素呈现交叉耐药，本研究中14株分离菌对卡那霉素和克林霉素的耐药率分别为73.3%和53.3%。

4 结 论

本研究通过分离鉴定牛链球菌，分析其溶血性、对小鼠的致病性及对抗菌药物的敏感性，阐明了牦牛源链球菌的部分生物学特性，为该地区牛链球菌性腹泻的临床治疗及防控提供一定科学依据。

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（责任编辑 董晓云）

中图分类号：S823.8＋5

文献标识码：A

文章编号：1671－7236（2016）12－3314－08

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.034

收稿日期：2016－04－15

基金项目：西南民族大学研究生创新项目（CX2016SZ092）；国家民委科技项目（14XNZ025）

作者简介：张兴民（1990－），男，甘肃张掖人，硕士，研究方向：畜禽传染病诊断与防制，E－mail：2197345890＠qq.com

通信作者：＊张焕容（1968－），女，重庆江津人，博士，教授，研究方向：畜禽传染病诊断与防制，E－mail：zhrong05＠163.com

Isolation，Identification and Biological Characteristics Research ofStreptococcusbovisfrom Yak

ZHANG Xing－min，ZHANG Huan－rong＊，TANG Cheng，ZHU Ming－xin
（CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041，China）

Abstract：The objective of this study was to isolate and identifyStreptococcusbovisfrom yak，and detect their hemolytic，pathogenicity and antimicrobial susceptibility.45fecal samples collected from the diarrheal yaks in Aba state in Northwest Sichuan province were used to isolateStreptococcusboviswith sheep blood culture media under 37℃and 5%CO2condition cultured for 24h.The isolated bacteria were identified by 16SrRNA amplification and sequencing.Total 14Streptococcusboviswere identified，among which，8Streptococcuslutetiensisstrains and 6Streptococcus gallolyticusstrains.9Streptococcusbovisstrains showedαhemolytic，and 5Streptococcus bovisshowedβhemolytic.BothStreptococcuslutetiensisandStreptococcusgallolyticuscaused the experimental mice mild diarrhea.The isolated 14Streptococcusboviswere sensitive to penicillin，cefotaxime，vacomycin，acetylspiramycin，ciprofloxacin，rifampicin，teicoplanin，ampicillin and gentamicin，and highly tolerant to streptomycin，kanamycin，lincomycin，erythrocin，tetracycline and clindamycin.This study illustrated the biological characteristics of the isolatedStreptococcusbovisfrom yak，which made the basis for the prevention and control of diseases caused byStreptococcusbovis.

Key words：yak；Streptococcusbovis；isolation and identification；antimicrobial susceptibility