菊花病毒脱除及其检测技术研究进展

郭倩楠，张文芳，贾小玉，殷 莹，闫文懿，崔智慧，赵喜亭，2，3*

（1.河南师范大学生命科学学院，河南新乡 453007；2.河南省高校道地中药材保育及利用工程技术研究中心，河南新乡 453007；3.河南省绿色药材生物技术工程实验室，河南新乡 453007）

菊花病毒脱除及其检测技术研究进展

郭倩楠1，张文芳1，贾小玉1，殷 莹1，闫文懿1，崔智慧1，赵喜亭1，2，3*

（1.河南师范大学生命科学学院，河南新乡 453007；2.河南省高校道地中药材保育及利用工程技术研究中心，河南新乡 453007；3.河南省绿色药材生物技术工程实验室，河南新乡 453007）

介绍感染菊花的2种主要优势病毒菊花B病毒（CVB）和番茄不孕病毒（TAV），从光合作用、N代谢水平及抗膜脂过氧化能力3个方面探讨了病毒病对菊花产量和品质的影响，同时对菊花病毒的脱除及检测技术进行了比较概述，认为超低温疗法在菊花病毒的脱除中具有良好的发展前景，芯片技术是菊花病毒快速检测技术的重要发展方向。

菊花；病毒；脱毒技术；检测技术

菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）为菊科菊属多年生草本植物，中国十大名花之一，集观赏、食用、药用、茶饮为一体，具有重要经济价值。生产上主要采用扦插、分株、嫁接等繁殖方法，但营养繁殖易感染病毒病，对菊花质量影响较大。然而防治菊花病毒病还没有特效药，目前采用病毒脱除技术获得无毒苗。菊花脱毒技术主要有茎尖培养及结合热处理、超低温疗法。检测技术主要有指示植物法、电镜观察法、酶联免疫吸附法（ELISA）、分子生物学（单一RT-PCR、多重RTPCR、实时荧光定量PCR、荧光环介导逆转录等温扩增RT-LAMP）技术。

1 病毒病对菊花的为害

1.1 侵染菊花的主要病毒

世界范围感染菊花的病毒已有20多种［1］，在我国主要有菊花B病毒（CVB）、番茄不孕病毒（TAV）、烟草花叶病毒（TMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、马铃薯X病毒（Potato virus X）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y）、番茄斑萎病毒（TSWV）、菊花矮化类病毒（CSVD）等8种［2-3］。CVB和TAV是感染菊花的优势病毒［4-5］，能感染包括墨菊、怀菊、瓜叶菊、野菊、金鱼草、金盏菊、翠菊、蜡菊及罗纳菊等多种菊花［6］。TAV在1949年于马铃薯中首次被发现［7］，为RNA病毒，属于雀麦花叶病毒科黄瓜花叶病毒属，通过汁液和蚜虫非持久式传播，造成菊花植株矮化、花变形、无叶片及生殖能力丧失等［8］。CVB于1952年被鉴定出是单链正义RNA病毒，属于线性病毒科香石竹潜隐病毒属，通过插条和汁液进行传播，使感染的菊花叶呈斑驳状或坏死斑［8-9］。其在菊花上的钝化温度为70～80℃，稀释终点为10-2～10-4［10］。

1.2 病毒病对菊花品质和产量的影响

菊花为世界“四大切花”之一，销量居首。但常因受到病毒侵染而使其生理生化活动受到影响，进而造成菊花品质和产量大幅下降。病毒对菊花生理生化的影响主要表现在光合作用、N代谢水平及抗膜脂过氧化能力3个方面。

病毒感染菊花后叶绿体的结构和功能均受到损伤，光合能力下降。脱除CVB的杭白菊叶绿素含量、光合作用能力均明显增加［11］。脱除TAV、PVY后，亳菊叶绿素含量明显增加，且叶片较宽［12］。九月菊在脱毒后表现为植株粗壮、叶片宽等生长优势［13］。

N代谢是植物重要的生理生化过程，衡量指标主要有硝酸还原酶（Nitrate reductase，NR）的活性、可溶性蛋白的含量及游离脯氨酸的含量。N代谢的正常进行能使植株免受硝酸盐的毒害，进而长势优良。小黄菊脱除TAV后，其游离脯氨酸含量及NR活性均提高，N代谢能力增强［2］。

植物感染病毒后膜脂过氧化程度加剧、保护酶活性降低、产量和品质大幅下降。与未脱除TAV病毒的小黄菊株系相比，脱除TAV后，丙二醛（MAD）、H2O2含量及O2·-生成速率均显著降低，保护酶（超氧化物岐化酶SOD、过氧化物酶POD、过氧化氢酶CAT、抗坏血酸过氧化物酶APX、硝酸还原酶GR）的活力均显著增高，药用成分绿原酸的含量增幅在7.6%～39.7%、木犀草苷的含量增幅在15.7%～62.6%［2］。怀白菊脱除TAV后，O2·-生成速率、MDA的含量降幅最大值超30%，APX活性升高幅度最高值也超50%，产量和品质均得到显著改善［14］。综上，病毒感染菊花引起光合作用下降、N代谢水平和抗膜脂过氧化能力降低，严重影响其产量和品质。

2 菊花脱毒技术的研究现状

目前菊花病毒病大多采用农药防治，而农药的使用会造成土壤污染、农药残留以及病毒抗药性增强的问题。病毒的抗药性使农药用量加大，形成恶性循环，而菊花病毒的脱除技术是一项传统的绿色环保技术，能使菊花提纯复壮，增强对病毒的抗性。有关菊花病毒的脱除技术主要有茎尖培养，以及结合热处理和超低温疗法。

2.1 茎尖培养及其结合热处理

茎尖培养是传统的菊花脱毒技术之一。Morel等［15］于1952年对大丽菊的花叶病毒脱除中而建立。茎尖培养是利用植物茎尖含极少病毒或几乎不含病毒（即免疫区）而进行的组织培养［16-17］。一般来说，茎尖越短，其病毒含量越少，脱毒效率越高，但植物的成活率降低，因而对于不同品种的菊花其茎尖的切取长度还需通过试验来进行探究。当茎尖长度短于0.3 mm时，菊花品种寒小白CVB的脱毒效率高达66.7%，但成活率低至6%；而当茎尖长度为0.7～1.0 mm时，成活率最高（90%），但脱毒率最低（仅为6.67%）［18］；当茎尖长度为0.4～0.5 mm时，墨菊CMV、CVB、TMV脱毒率较好分别为61.9%、63.2%、55.0%，茎尖成活率为66.7%［19］。

虽然茎尖培养法成本低，无污染，但由于茎尖十分小，很难剥离，因此在操作技术上有很大困难。故而常采用茎尖结合热处理来脱除菊花的病毒。

热处理结合茎尖培养法利用热处理能使植物顶端免疫区扩大，可切取较长的茎尖，因而操作难度得以降低，同时茎尖再生苗的成活率也大大增加。对墨菊分别进行茎尖培养、茎尖结合热处理，脱除CVB的比率分别为63.2%和86.7%［19］。利用热处理及茎尖结合热处理对菊花TAV进行脱除，脱毒率分别为20%和60%［20］。以上说明，茎尖结合热处理是一种较好的脱毒方法。

2.2 超低温疗法

超低温疗法是一种以超低温保存（Cryopreservation）与植物组织培养相结合的新型植物脱毒技术。原理为：在低温下，病毒所在的植物细胞液泡中水分含量高，易产生结晶杀死病毒，而分生组织胞质浓，抗冻性强，易存活［21］。该技术已应用于许多植物的病毒脱除中，如香蕉的CMV脱除率为30%［22］、葡萄的葡萄A病毒（GVA）的脱毒率为97%［23］、柑橘的黄龙病菌（HLB）的脱除率高达90.9%～94.3%［24］。在菊花上，低温疗法主要运用在种质资源的保存上，在脱毒方面的研究报道较少。但因该技术处理周期短且能很好地保持植物的遗传稳定性，因而在菊花病毒的脱除中具有良好的发展前景。研究表明，运用该方法脱除非洲菊妃子CMV和TMV，脱除率为100%［25］。

3 菊花病毒检测技术的研究现状

将菊花进行脱毒再生后，检测脱毒苗的脱毒状况是必要的，因为病毒的检测可以说明菊花的脱毒方法是否有效，从而为下一步工作打下基础。检测菊花病毒的技术主要有指示植物法、电镜观察法、酶联免疫吸附法和分子生物学方法。

3.1 指示植物法

指示植物（生物学检测法）是比较传统，也是早期使用的一种检测植物感染病毒与否的技术，是根据病毒能够侵染特定的寄主并使寄主产生特定的症状类型而进行检测的方法［26］。病毒侵染菊花后常出现花叶、条纹、斑驳、矮化、枯斑、畸形等明显症状［27］。常用的方法包括汁液摩擦接种［28］和嫁接传染［29］。

指示植物法操作简单，且结果直观，但在自然环境中，菊花常受到多种病毒侵染，因而很难根据指示植物的症状鉴定出病毒的确切种类。

3.2 电镜观察法

电镜观察法是在电子显微镜下观察病毒粒子的大小及病毒外壳蛋白的形状，从而鉴定出病毒的技术［30］。自Kausche等［31］首次在电镜下看到TMV以来，电镜已成为植物病毒研究必不可少的手段之一。因电子的穿透力低，所以常用超薄切片技术结合免疫电镜才能鉴定出病毒。利用醋酸氧铀负染，在电镜下发现了TAV［32］。CMV的6个不同株系的区分利用了负染、超薄切片技术与电镜技术相结合［33］。

电镜法的优点是能够准确且较灵敏的检测菊花病毒，然而此方法需要先进的仪器设备，花费大，且须掌握准确的操作技术。

3.3酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法（ELISA）是一种灵敏且能大量检测植物病毒的技术。其原理为：将待测物加入到酶与抗体或抗原结合的复合物中，依据底物的显色反应来判断待测物是否有病毒及其种类［34］。目前应用最多的是双抗体夹心法（DAS-ELISA）和A蛋白双抗夹心法（PAS-ELISA）。经DAS-ELISA法，检测出菊花的4个品种均感染CVB，其中1种还感染TAV［35］。利用DAS-ELISA法能鉴定出菊花的TAV［36］。此外，利用PAS-ELISA也检测出杭白菊中含有菊花B病毒［11］。

酶联免疫吸附法因灵敏度高、特异性强被广泛使用在菊花病毒的检测中，但该技术只能检测1种病毒，且会出现假阴性。

3.4分子生物学法

分子生物学检测法是通过检测病毒核酸（DNA或RNA）来证实病毒的存在，主要包括核酸杂交技术、双链RNA（dsRNA）电泳技术及反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）。在菊花上主要应用RT-PCR技术。

RT-PCR法比酶联免疫吸附法更为灵敏，并能检测多种菊花病毒的脱毒技术。其原理是以RNA为模板，反转录出cDNA，然后在体外经PCR扩增，根据电泳图谱分析来检测植物感染病毒与否［2］。随着RT-PCR技术的发展，RT-PCR技术又分为单一RT-PCR、多重RT-PCR、实时荧光定量PCR及RT-LAMP技术。

3.4.1 单一RT-PCR

指利用一种病毒的引物，转录出cDNA后再用PCR扩增，从而检测出病毒的技术。其特点是只能检测1种病毒。怀菊花TAV病毒的检测［2］及CVB的鉴定［1］就是利用此方法。

3.4.2 多重RT-PCR

指能在一个反应体系中加入多种病毒引物进行反转录，从而检测多种病毒的检测技术。因菊花在自然条件下常受到病毒的复合感染，所以该方法在现阶段较为流行。利用二重RT-PCR能同时检测出菊花的CVB和TAV［37］。利用四重RT-PCR能检测菊花2种病毒（CVB和TVA），以及2种类病毒，CSVD和菊花枯黄斑点类病毒（CChMVd）［38］。目前该技术能一次检测出菊花的5种病毒（TAV、CVB、CMV、TMV和PVY）及2种类病毒（CSVD，CChMVd）［39］。

3.4.3 实时荧光定量PCR

是一种利用荧光探针与PCR反应产物杂交后所产生的荧光量定量检测植物病毒的技术。该技术既能避免假阳性的出现，也能定量检测病毒。利用该方法可检测至少50 fg的TSWV［40］。菊花病毒（CMV、TMV）和类病毒（PVY）的实时荧光定量PCR检测技术体系已成功建立［41］。

3.4.4 RT-LAMP技术

是一种于21世纪初建立的新型检测病毒的手段。在60～65℃等温条件下，LAMP能在具有链置换活性的DNA聚合酶下识别目的基因6个区段的4条引物，进而扩增目的基因［42］。由于该技术能一次性快速地反转录和扩增RNA病毒，所以在菊花病毒检测中得到快速发展。在菊花TSWV检测中，RT-LAMP的灵敏度比RT-PCR高出100倍［43］。此外，在菊花TAV的检测中也发现，RTLAMP比RT-PCR更灵敏［44］。目前已在单一RTLAMP技术上发展出多重RT-LAMP。Liu等［45］于2014年建立了菊花CVB和CSVD的二重RT-LAMP技术。

4 问题及展望

菊花品种不同，脱毒技术不尽相同。菊花品种繁多，遗传背景复杂，加之长期的营养繁殖使病毒感染严重，同时大面积生产时，连作也会造成病毒富集而大量减产。因此，根据不同菊花品种建立更为有效的脱毒技术是研究的重要课题。国际上迅速发展的芯片技术，是将大量DNA探针片段有序地固化于支持物表面，与已标记的DNA分子杂交，再对杂交信号进行检测分析，从而识别样品中存在的特异性核酸序列［1］。此法是DNA杂交技术与荧光标记技术相结合的基因水平检测技术，具有灵敏度高和可靠性强的特点，是菊花病毒快速检测技术的重要发展方向［46］。

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（责任编辑：张瑞麟）

S436.8

：A

：0528-9017（2016）12-2035-04

文献著录格式：郭倩楠，张文芳，贾小玉，等.菊花病毒脱除及其检测技术研究进展［J］.浙江农业科学，2016，57（12）：2035-2039.

10.16178/j.issn.0528-9017.20161234

2016-08-18

国家自然科学基金（31372105）；河南师范大学大学生创新创业训练计划（20140134）

郭倩楠（1993—），女，河南洛阳人，在读本科，生物科学专业，E-mail：237074891@qq.com。

赵喜亭（1971—），女，河南洛阳人，副教授，博士，从事植物生理与生物技术的教学与科研工作，E-mail：zhaoxt0411 @126.com。