结核分枝杆菌mpt59和esxA融合基因编码蛋白的原核表达及免疫原性观察*

石　洁，朱岩昆，郑丹薇，马晓光，王少华，李　辉，邢　进#，吴彩霞

1)河南省疾病预防控制中心结核病防控所 郑州 450016　2)河南省疾病预防控制中心门诊 郑州 450016



结核分枝杆菌mpt59和esxA融合基因编码蛋白的原核表达及免疫原性观察*

石洁1)，朱岩昆1)，郑丹薇1)，马晓光1)，王少华1)，李辉1)，邢进1)#，吴彩霞2)

1)河南省疾病预防控制中心结核病防控所 郑州 4500162)河南省疾病预防控制中心门诊 郑州 450016

关键词结核分枝杆菌；mpt59基因；esxA基因；血清学诊断；原核表达

摘要目的：获取结核分枝杆菌mpt59和esxA基因编码的原核表达融合蛋白，并将该蛋白初步用于结核患者的快速诊断。方法：PCR扩增含有柔性链接肽段的esxA核苷酸序列，并将其连接至原核表达载体pET28a上，再将mpt59连接至pET28a-esxA上。该融合蛋白在大肠杆菌BL21中原核表达后，用镍珠子进行亲和纯化。采用垂直电泳和免疫印迹分析重组蛋白，并用于结核患者的诊断。结果：成功构建了原核表达载体pET28a-esxA-mpt59，转化大肠杆菌BL21后经诱导产生了高水平的表达产物。用该纯化蛋白进行ELISA检测，结果表明其诊断结核的灵敏度为97.8%，特异度为100%。结论：构建了含mpt59和esxA融合抗原基因的原核表达载体，并诱导表达了融合蛋白，为进一步研究结核分枝杆菌疫苗或诊断试剂奠定了基础。

AbstractAim: To obtain bacterially expressed prokaryotic protein encoded by mpt59 and esxA from Mycobacterium tuberculosis, and to apply this protein for rapid diagnosis of tuberculosis patients.Methods: The nucleotide sequence of esxA gene containing flexible peptide linker was obtained from Mycobacterium tuberculosis using PCR and was linked to pET28a expression vector.Then mpt59 gene was cloned into the pET28a-esxA.The fusion protein was expressed in E.coil BL21 and purified by Ni-NTA. The purified fusion protein was confirmed by SDS-PAGE and Western blot analysis, and was used for TB diagnosis.Results: The recombinant expression vector pET28a-esxA-mpt59 was successfully constructed. The E.coli BL21 strains with recombinant vector showed high level expressions of fusion protein after IPTG induction. The ELISA assay with purified protein for detecting Mycobacterium tuberculosis antibody showed a sensitivity of 97.8% and a specificity of 100%.Conclusion: The expression of recombinant fusion protein of Mycobacterium tuberculosis mpt59 and esxA lays a basis for further studies on researches such as vaccine or diagnostic reagent.

中国作为全球结核病高负担国家之一，结核病人口数量位居全球第二[1]。卡介苗作为一种活性减弱的牛分枝杆菌，是目前使用最广泛的疫苗之一，对感染分枝杆菌的动物模型有很强的保护作用。尽管卡介苗抗原能预防婴幼儿中的结核性脑膜炎和播散型结核，但对成年人的保护效果较差，在热带地区临床试验中甚至无保护[2-3]。不同国家卡介苗的保护效果从0%～80%不等[4-5]。研究[6-7]发现结核分枝杆菌早期分泌的靶蛋白ESAT-6是由结核分枝杆菌合成的有效T细胞抗原，其对应的基因esxA位于卡介苗与结核分枝杆菌的基因差异区RD-1区域。结核分枝杆菌分泌蛋白中，Ag85复合物家族成员中Ag85A和Ag85B被认为是人体对抗结核分枝杆菌时产生T细胞应答的主要靶蛋白，因此常被作为免疫应答候选蛋白[8]。该研究以结核分枝杆菌分泌抗原Ag85B和ESAT-6的编码基因mpt59和esxA为研究对象，构建了含有His标签融合抗原基因的原核表达载体，经体外高效表达和纯化后，用于疑似结核病患者的免疫学检测，为结核病的早期诊断和预防奠定了基础。

1材料与方法

1.1材料大肠杆菌BL21(DE3)和DH10B，结核分枝杆菌标准菌株H37Rv，原核表达载体pET28a均由作者所在的实验室保存。限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、SalⅠ，胶回收试剂盒，T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司，其他试剂购自上海生工生物工程有限公司，His纯化珠子购自GE公司。

提取结核分枝杆菌基因组DNA[9]，首先扩增esxA基因，并将其构建到含有His标签的原核表达载体pET28a中，化学转化至大肠杆菌DH10B中，菌落PCR验证挑取阳性克隆。再将构建好的中间载体用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后连入扩增后的mpt59基因片段，菌落PCR初步挑取阳性克隆，并进行单个基因和融合基因的双酶切验证，最后送至上海英骏生物技术有限公司进行测序及比对。

1.3融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21，进行IPTG诱导表达，分别在30和37 ℃条件下诱导4和6 h，考马斯亮蓝染色观察目的蛋白的表达情况。最后将最优表达条件下获得的蛋白用His纯化珠子进行亲和层析和洗脱，用SDS-PAGE电泳和免疫印迹检测融合蛋白的纯化情况[9]。

1.4纯化融合蛋白对疑似结核病患者的免疫原性检测在新密市疾控中心连续收集根据肺部影像学初步诊断的可疑结核病患者的痰液和血清以及来自健康体检者的血清(对照)，最终收集到83份可疑结核病患者的痰液和血清以及56份健康体检者的血清。对可疑结核病患者的痰液进行传统的痰培养检测。

以0.75 mg/L纯化的融合蛋白包被96孔板，对83份可疑结核病患者的血清样本和56份健康人血清按1100稀释后进行ELISA检测，同时以碳酸盐包被缓冲液作为空白对照,结果见表1。于450 nm处以空白对照孔调零后测各孔OD值，大于规定的空白对照OD值的2.1倍即为阳性。

2结果

2.1mpt59和esxA融合基因载体构建及菌落PCR结果验证将编码ESAT-6抗原的基因esxA构建至含有His标签的表达载体pET28a上，菌落PCR验证挑取的克隆均为阳性克隆(图1)。选取其中测序正确的阳性克隆，用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切后，加入去掉终止密码子的mpt59核苷酸序列，进一步通过菌落PCR验证，结果见图2。

图1　esxA菌落PCR鉴定

图2　mpt59菌落PCR鉴定

M：DNA Marker；1~2、4~7：mpt59基因阳性克隆PCR产物；3：mpt59基因阴性克隆PCR产物。

2.2融合基因载体的双酶切鉴定融合基因载体经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后，切出大约300 bp的esxA基因，经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，切出mpt59目的片段(图3)。同时用BamHⅠ和SalⅠ双酶切后，可切出大约1 200 bp的融合基因条带(图4)，进一步表明成功构建了融合基因载体。

图3　单个基因双酶切鉴定结果

M：DNA Marker；1：融合基因载体经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后的结果；2：融合基因载体经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后的结果。

图4　重组质粒pET28a-mpt59-esxA融合基因的酶切鉴定

M：DNA Marker；1：融合基因载体经BamHⅠ和SalⅠ双酶切后的结果。

2.3融合蛋白表达条件的优化在终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导下，当诱导温度为30 ℃时，融合蛋白表达不明显，而当温度提高至37 ℃时，与对照组相比，在相对分子质量40 000处有一明显的优势表达条带，并且诱导4和6 h目的蛋白的表达量无明显差别(图5)。

图5　融合基因在大肠杆菌BL21中表达产物的SDS-PAGE电泳鉴定

M：蛋白Marker；1：转化空载体的BL21未表达蛋白条带；2、3：转化表达载体的BL21在IPTG、37 ℃的条件下诱导4和6 h时的蛋白条带；4、5：转化表达载体的BL21在IPTG、30 ℃的条件下诱导4和6 h时的蛋白条带。

重组蛋白用His纯化珠子纯化洗脱后，分别进行考马斯亮蓝染色和免疫印迹分析，结果见图6。考马斯亮蓝染色结果显示融合蛋白经表达纯化后，在40 000处有一明显亮带，并且条带单一(图6A)；免疫印迹结果表明与图6A相应蛋白相对分子质量处有明显反应条带的出现(图6B)。

图6　融合蛋白的考马斯亮蓝染色(A)及免疫印迹检测(B)结果

2.4纯化融合蛋白的免疫原性检测结果见表1。His-Ag85B-ESAT-6融合蛋白对所检测样本的灵敏度为97.8%，特异度为100%。

表1　ELISA方法与传统培养方法比较　例

3讨论

肺结核作为一种危害全球人类健康的疾病，每年有100万的新发病例，17万人因此而死亡；可通过开发有效的结核病疫苗、改进的诊断试剂以及新型的短程化疗方案实现全球对结核病的控制目标[10]。

目前最常用的诊断方法是对痰液中的抗酸杆菌进行显微镜观察即痰涂片，但该方法灵敏度低，只有30%左右[11]。尽管痰培养比痰涂片相对灵敏，但是该方法的结果判断需要花费4~8周的时间，并且对实验条件要求较高，有些结核病高负担地区的实验室很难达到。因此急需开发快速敏感的实验室诊断方法。

由于免疫学诊断具有快速简单的特点，近年来越来越多的研究致力于开发新型的免疫学诊断产品用于结核病的检测。而检测结核分枝杆菌抗原及针对这些抗原产生的抗体的研究受到越来越多的重视，因为其能鉴定潜伏感染的肺结核患者。大量结核分枝杆菌抗原，包括天然抗原、半合成抗原、重组抗原都被有效用于肺结核和肺外结核的诊断[12-13]。结核分枝杆菌分泌蛋白中，Ag85复合物家族成员(Ag85A、B、C)作为快速生长结核分枝杆菌的主要分泌蛋白，含量占所有分泌蛋白的30%，被认为是最具潜力的疫苗候选物。其中Ag85B作为一种DNA疫苗，对结核分枝杆菌小鼠感染模型产生了部分性保护作用[14]。结核分枝杆菌早期分泌的靶蛋白ESAT-6是由结核分枝杆菌合成的有效的T细胞抗原，其对应的基因为esxA。

目前市面上胶体金产品对结核病患者检测的灵敏度只有60%~70%[15-16]。为进一步提高抗原检测的灵敏度和特异度，作者在前期工作[17]的基础上，在mpt59原核表达载体上进一步融合了esxA基因，并在体外进行重组表达条件的优化；在优化条件下对融合抗原进行高效表达，用His纯化珠子亲和层析；最终通过电泳和免疫印迹检测最终蛋白产物，结果表明其为单一蛋白条带。用该纯化蛋白对83例可疑结核病患者及56例健康人的血清进行ELISA诊断，结果显示该融合蛋白对所检测样本的灵敏度为97.8%，特异度为100%，初步证明该蛋白可用于结核病患者的快速诊断，并为进一步研究二者的免疫原性奠定了基础。同时，作者在前期工作的基础上增加了样本量，从而提高了结论的适用性。在后续研究中将进一步增加样本量及以将该融合抗原结合其他结核抗菌抗原对患者的免疫原性进行深入的研究。

参考文献

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*国家自然科学基金项目81173127,81171060；河南省杰出青年基金项目074100510020；河南省教育厅基础研究项目13A310663；河南省科技厅基础与前沿技术研究计划项目142300410206

Prokaryotic expression and immunogenicity analysis of mpt59 and esxA fusion gene from Mycobacterium tuberculosis

SHIJie1),ZHUYankun1),ZHENGDanwei1),MAXiaoguang1),WANGShaohua1),LIHui1),XINGJin1),WUCaixia2)

1)HenanResearchInstitutionforTuberculosisControl，HenanProvinceCenterforDiseaseControlandPrevention,Zhengzhou4500162)TheOutpatientDepartment，HenanProvinceCenterforDiseaseControlandPrevention,Zhengzhou450016

Key wordsMycobacterium tuberculosis; mpt59 gene; esxA gene; serological diagnosis; prokaryotic expression

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.009

中图分类号R446.6

通信作者#，1966年6月生，硕士，主任医师，研究方向：结核病防控，E-mail:hncdcxj@163.com