线粒体靶向DQA-DOX连接物的制备及其逆转肿瘤耐药活性研究

线粒体靶向DQA-DOX连接物的制备及其逆转肿瘤耐药活性研究

宋彦峰，滕增辉，崔晗，刘道洲，叶威良，张邦乐，周四元*

(第四军医大学药学院药剂学教研室，西安710032)

摘要：目的为寻找线粒体靶向的抗肿瘤药物，将阿霉素(doxorubicin，DOX)与地喹氯铵(dequalinium,DQA)连接形成DQA-DOX，观察DQA-DOX的抗肿瘤作用。方法合成DQA-DOX连接物，通过MTT、细胞摄取实验对DQA-DOX进行体外抗肿瘤活性研究。结果细胞毒性实验显示：与游离DOX相比，DQA-DOX对A549细胞的毒性比游离DOX明显低，但DQA-DOX对耐DOX细胞MCF-7/ADR细胞的毒性比游离DOX显著增强。共聚焦显微镜观察结果显示：MCF-7/ADR细胞给予游离DOX后，DOX在细胞浆和细胞核分布得很少；MCF-7/ADR细胞给予DQA-DOX后，DQA-DOX特异性地分布于线粒体。结论DQA-DOX具有对抗阿霉素耐药作用，有进一步研究的价值。

关键词：地喹氯铵;阿霉素;线粒体;多药耐药

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.03.019

中图分类号：R944

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2015)03-0283-04

Abstract:ObjectiveIn order to find mitochondrial targeting anti-tumor molecule, DQA-DOX conjugate was synthesized and its antitumor activity was evaluated. Methods The anti-tumor activity of DQA-DOX in vitro was studied by MTT method. Subcellular distribution of DQA-DOX in MCF-7/ADR cells was observed with confocal laser scanning microscopy. Result DQA-DOX showed lower cytotoxicity as compared with free DOX on A549 cells. However, on MCF-7/ADR cells, DQA-DOX exhibited higher cytotoxicity as compared with free DOX. DQA-DOX mainly distributed in MCF-7/ADR cells of mitochondria. Conclusion DQA-DOX can overcome the resistant of DOX on MCF-7/ADR cells. DQA-DOX is worthy of further investigation.

基金项目：陕西省自然科学基金(编号：2013JQ4026)

作者简介：宋彦峰，男，硕士研究生

收稿日期：(2014-12-02)

Preparation and anti-tumor activity of mitochondrial targeting DQA-DOX conjugate

SONG Yanfeng, TENG Zenghui, CUI Han, LIU Daozhou,YE Weiliang, ZHANG Bangle, ZHOU Siyuan*(Department of Pharmaceutics, School of Pharmacy, the Fourth Military Medical University, Xi′an 710032, China)

Key words: dequalinium; doxorubicin; mitochondria; multi-drug resistance

*通信作者：周四元，男，教授

阿霉素(doxorubicin，DOX)是一种临床常用的广谱抗肿瘤药物，但由于其心脏毒性及耐药率高严重限制了其临床应用。DOX的主要作用机制包括抑制拓扑异构酶Ⅱ、破坏DNA以及诱导活性氧的产生[1-3]。肿瘤细胞新陈代谢非常旺盛，因此需要更多的能量；当药物直接干扰线粒体的呼吸链会最终导致肿瘤细胞的死亡。因此，靶向损伤线粒体具有对抗肿瘤细胞耐药的潜力[4-8]。DOX在线粒体累积能够引起活性氧的产生以及线粒体呼吸链的破坏，最终导致线粒体脂质氧化以及细胞色素C释放增加。由于线粒体膜具有高的负电性，因此，具有高脂溶性与强正电性特征的脂质阳离子可选择性地蓄积于线粒体。地喹氯铵(dequalinium，DQA)是一种对线粒体具有高亲和力的脂质阳离子，将它连接到小分子药物上或者递药系统中有可能发挥线粒体靶向的作用。因此，本文通过将DQA与DOX以化学键相连合成一种新型的具有线粒体靶向作用的DOX衍生物DQA-DOX，并观察其抗肿瘤活性。

1仪器与材料

1.1仪器INOVA-400 MHz 型超导核磁共振仪(美国Varian公司)；Waters Quatro-premier质谱仪(美国Waters 公司)；Leica TCS SP2-激光共聚焦显微镜(德国LEICA公司)；酶标仪(美国Awareness公司)。

1.2材料二环己基碳二亚胺(DCC)、二甲氨基吡啶(DMAP)、三乙胺(TEA)、丁二酸酐，均购自国药集团化学试剂有限公司；地喹氯铵(DQA)购自宁波亿诺化学品有限公司； 3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)购自北京鼎国生物技术有限责任公司；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)购自碧云天生物技术研究所。线粒体探针MitoTrack green购自Invitrogen公司。RPMI 1640培养液、胎牛血清均购自HyClone公司。人肺癌A549细胞购自中国科学院上海药物研究所;MCF-7/ADR细胞(耐DOX细胞)购自上海美轩生物科技有限公司。细胞培养于含10% 胎牛血清的培养液中，在37 ℃、5% CO2孵箱中孵育，每1~2 d更换1次培养液。

2方法

2.1地喹氯铵-阿霉素连接物(DQA-DOX)的合成DQA-DOX的合成路线如图1所示。称取60 mg 丁二酸酐加入到4 mL乙醇中，再依次加入73.3 mg 的DMAP和123.6 mg的 DCC，活化4~5 h，在上述溶液中加入158.1 mg DQA，再加入三乙胺(TEA)180 μL，室温避光搅拌，TLC检测。向反应液中加入乙醇过滤，将滤液蒸干，得目标产物地喹氯铵-琥珀酸酐连接物(DQA-SUC)240 mg。

将240 mg DQA-SUC用20 mL乙醇溶解，加入137 mg EDC，83 mg NHS，活化3 h。将100 mg 盐酸阿霉素置于7 mL二氯甲烷中，加入100 μL三乙胺，室温避光搅拌1 h，然后加入到DQA-SUC的乙醇溶液中，反应12 h，TLC检测。反应结束后，过硅胶柱分离产物，得261.6 mg DQA-DOX。应用1H NMR、MS等方法对合成的目标化合物进行结构鉴定。

图1DQA-DOX的合成路线示意图

Fig.1 Synthetic scheme of DQA-DOX

2.2细胞毒性实验将MCF-7/ADR和A549细胞分别接种于96孔培养板中(每孔6×103个细胞，体积200 μL)。12 h后，吸去培养液。将DOX和DQA-DOX用 RPMI 1640培养液分别稀释成50， 10， 5和1 μmol·L-1(均为折合阿霉素的浓度)加入培养板中(每孔200 μL)，继续培养48 h；随后加入MTT溶液(5 mg·mL-1)20 μL，孵育4 h。吸弃培养液，再加入150 μL DMSO，酶标仪测定490 nm处的吸光度。

2.3caspase 3活性检测caspase 3在细胞凋亡过程中发挥重要的作用。采用caspase 3活性检测试剂盒测定caspase 3的活性。将MCF-7/ADR和A549细胞接种到培养皿中，24 h后，吸弃培养液。将DOX和DQA-DOX用 RPMI 1640培养液分别稀释成10.0 μmol·L-1(均为折合阿霉素的浓度)加入到培养皿中，以加空白培养液为对照组。24 h后，按说明书处理细胞样品。

2.4DQA-DOX在肿瘤细胞内的分布将MCF-7/ADR细胞接种到含有盖玻片的24孔板(0.5×106细胞/孔)，孵育24 h后，弃去培养液，加入10.0 μmol·L-1(均为折合阿霉素的浓度)DOX和DQA-DOX，孵育3 h。弃去培养液，用37 ℃ pH7.4的PBS洗3次，每次5 min；加入500 μL DAPI (100 μg·mL-1)孵育15 min，弃去培养液，用37 ℃ pH7.4的PBS洗3次；加入500 μL Mito Tracker (100 μmol·L-1)孵育1 h，弃去培养液，用37 ℃ pH7.4的PBS洗3次。加入1.5 g·mL-1多聚甲醛固定10 min。将盖玻片倒置在载玻片上，采用共聚焦显微镜观察。

3实验结果

3.1DQA-DOX的结构表征DQA-DOX的高效液相色谱图如图2所示，测得DQA-DOX的质量分数在99%以上。DQA-DOX的质谱图及核磁图如图3和图4所示，DQA-DOX的分子离子峰([M+H])为1 087。以氘代DMSO为溶剂，在INOVA-400 MHz 型超导核磁共振仪获得的DQA-DOX的特征1H NMR化学位移为8.2 (d, 2H), 7.9 (t, 2H), 7.7 (m, 1H), 6.2 (s, 2H), 5.3 (t, 2H), 4.9 (m, 1H), 4.7 (s, 6H), 3.8 (t, 3H), 3.1 (t, 2H), 2.9 (s, 6H), 2.1 (m, 4H), 1.7 (m, 4H), 1.2 (m, 16H), 1.0 (t, 3H)。

图2DQA-DOX的高效液相色谱图

Fig.2 The typical high performance liquid chromatogram of DQA-DOX

图3DQA-DOX的质谱图

Fig.3 The mass spectrum of DQA-DOX

图4DQA-DOX的核磁氢谱图

Fig.41H NMR spectrum (dissolved in DMSO) of the DQA-DOX

3.2DQA-DOX的细胞毒性如图5所示，与游离DOX相比，DQA-DOX对A549细胞的细胞毒性较低。但是DQA-DOX对MCF-7/ADR细胞的细胞毒性明显强于游离DOX。有文献报道[9]，亲脂性阳离子三苯基溴化膦(triphenylphosphonium,TPP)可以选择性地在线粒体聚集。当TPP与DOX连接形成TPP-DOX时，与游离DOX相比，TPP-DOX对MDA-MB-435/DOX 细胞具有较强的细胞毒性。但是TPP-DOX对MDA-MB-435细胞的细胞毒性低于DOX[10]。

图5DQA-DOX和DOX对A549细胞(A)和MCF-7/ADR细胞(B)的细胞毒性

注：与同浓度DOX组相比**P<0.01,*P<0.05

Fig.5 The cytotoxicity of free DOX and free DQA-DOX on A549 cells (A) and MCF-7/ADR cells (B)

Note:**P<0.01,*P<0.05 vs free DOX at the same concentration

3.3DQA-DOX对肿瘤细胞caspase 3活性的影响研究表明，阿霉素可以诱导细胞凋亡[11-12]。当A549细胞和MCF-7/ADR细胞经不同浓度的DQA-DOX与DOX处理24 h后，用caspase 3活性检测试剂盒测定细胞凋亡。结果如图6所示，与DOX相比，DQA-DOX诱导A549细胞凋亡的作用较弱；但DQA-DOX诱导MCF-7/ADR细胞凋亡的作用较DOX明显增强。

图6DQA-DOX和DOX对A549细胞(A)和MCF-7/ADR细胞(B)caspase 3活性的影响

注：与同浓度DOX组相比**P<0.01,*P<0.05

Fig.6 The effect of DOX and DQA-DOX on caspase 3 activity in A549 cells (A) and MCF-7/ADR cells (B) in 24 h

Note:**P<0.01,*P<0.05 vs free DOX at the same concentration

3.4DQA-DOX在肿瘤细胞内的分布通过激光共聚焦显微镜观察DQA-DOX在肿瘤细胞中的分布情况。结果如图7所示，游离DOX与MCF-7/ADR细胞孵育后，阿霉素在细胞核内分布得很少； DQA-DOX与MCF-7/ADR细胞孵育后，DQA-DOX主要分布在肿瘤细胞的线粒体。因此DQA-DOX可以诱导更多的细胞凋亡。此结果与细胞毒性实验结果相吻合。

图7DOX(A)与DQA-DOX(B)在MCF-7/ADR细胞中的分布

Fig.7 The distribution of DOX (A) and DQA-DOX (B) in MCF-7/ADR cells

4讨论

在一些研究中，利用对线粒体有高亲和力的亲脂性阳离子将抗肿瘤药物递送到肿瘤细胞线粒体来克服肿瘤的耐药性[13-14]。递送DOX到线粒体后可以通过不同机制引起细胞的死亡，例如:DOX引起肿瘤细胞内活性氧自由基(ROS)量的增加，也可以激活与细胞凋亡相关的蛋白(如caspase)，DOX还可作用于线粒体DNA或拓扑异构酶Ⅱ引起线粒体的损伤。因此，比通过将DOX递送到线粒体有可能克服肿瘤细胞对DOX的耐药。多药耐药机制包括像P糖蛋白的药物泵作用，阻止药物(例如DOX)在细胞的积累[15]。由于DQA强的疏水性与阳离子特性，它可以很容易通过磷脂双分子层，并且在带负电性的线粒体基质积累。正如期望的结果，DQA与DOX的连接物可以促进DOX在线粒体的累积。尽管DOX没有进入细胞核，但是对耐DOX的MCF-7/ADR细胞依然显现出明显的细胞毒性。

脂质体作为药物载体具有缓释、低毒及组织靶向性等特点[16]。有研究发现，DQA可以固缩质粒DNA自组装形成DQAsomes，DQAsomes不仅可特异地将线粒体DNA运送到线粒体，而且能够保护质粒DNA免于核糖核酸酶的降解，增加细胞对质粒DNA的摄取[17]。DQAsomes与模拟胞浆膜的脂质作用时，不能释放DNA，但与模拟线粒体膜且富含心磷脂的脂质作用时，则可以释放出DNA[18]。本文研究表明，DQA-DOX可特异蓄积于肿瘤细胞线粒体，能够逆转肿瘤细胞对阿霉素的耐药，具有进一步研究的价值。

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