薄膜-超声法制备芦丁固体脂质纳米粒的研究

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薄膜-超声法制备芦丁固体脂质纳米粒的研究

罗小燕，吕竹芬*，陈燕忠，王国强，林嘉成，邓广汉

(广东药学院药物研究所/广东省药物新剂型重点实验室，广州510006)

摘要：目的优化薄膜-超声法制备芦丁固体脂质纳米粒的处方。方法 以包封率为指标，采用正交设计优化法考察硬脂酸和大豆卵磷脂的用量、吐温-80和聚乙二醇-400的体积分数对包封率的影响，优选最佳处方。用透射电镜观察外观形态，用电位/纳米粒度分析仪分析纳米粒的粒径及Zeta电位，用透析法评价体外释药特征。结果 以最佳处方制备的芦丁固体脂质纳米粒呈类球形，平均粒径为 195.8±11 nm，Zeta电位为-20.65±0.6 mV，平均包封率为86.31%，72 h体外累积释放87.32%。结论 按最佳处方工艺制备的芦丁固体脂质纳米粒具有较高的包封率和较好的缓释效果。

关键词：芦丁；固体脂质纳米粒；体外释药；薄膜-超声法

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.03.015

中图分类号：R944

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2015)03-0267-04

Abstract:ObjectiveTo optimize the technique for preparing Rutin Solid Lipid Nanoparticles (RT-SLN) by film-ultrasonic dispersion.MethodsThe formulation was optimized by an orthogonal design.The entrapment efficiency was used as an index to investigate the factors of stearic acid， leci-thin，Tween-80 concentration and PEG-400 concentration.The electron microscope was used to observe the surface of RT-SLN by negative-dying.Particle size and Zeta potential were determined by laser particle analyzer，and drug release in vitro was evaluated by dialysis.ResultsRT-SLN were spherical. Its partical size was 195.8±11 nm，Zeta potential was -20.65±0.6 mV， and the entrapment efficiency was 86.31%.The cumulative release rate was 87.32% within 72 hours in vitro.ConclusionRutin Solid Lipid Nanoparticals could be prepared under the optimized conditions with high entrapment efficiency and in vitro sustained release characteristics.

基金项目：广东省教育厅科技计划项目(编号：GCZX-A0807)

作者简介：罗小燕，女，硕士研究生

收稿日期：(2015-03-02)

Preparation of Rutin Solid Lipid Nanoparticles by film-ultrasonic method

LUO Xiaoyan，LÜ Zhufen*，CHEN Yanzhong，WANG Guoqiang，LIN Jiacheng，DENG Guanghan(Institute of Material Medica/Key Laboratory of Advanced Drug Delivery of Guangdong Province，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China )

Key words: rutin；solid lipid nanoparticles；invitrorelease；film-ultrasonic method

*通信作者：吕竹芬，女，教授

芦丁(rutin)又称芸香苷，是槲皮素与芸香糖形成的苷，难溶于水，溶于甲醇，既可作为治疗药物，又可作为保健品[1-2]。其具有抗炎、抗病毒、抗辐射、抑制醛糖还原酶、抗过敏、利尿、解痉、镇咳等多种药理活性，临床用于防治脑溢血、视网膜出血、高血压、紫癜和急性出血性肾炎等疾病，但是芦丁脂溶性和水溶性都很差，口服几乎不被人体吸收[2-3]，生物利用度低。固体脂质纳米粒是以生理相容的高熔点脂质为骨架材料制成的新型药物传递载体，具有广泛的药物适应性、良好的生物相容性，可以提高难溶性药物的溶解度，减少药物毒性，延缓药物释放，促进药物吸收[4-8]。

本研究采用薄膜-超声法制备芦丁固体脂质纳米粒，以包封率为评价指标，采用正交设计法对处方进行优化，并对最优处方制备的纳米粒的形态、粒径、Zeta电位、体外释药行为进行评价，为芦丁新型给药系统的开发与应用奠定实验基础。

1仪器与试药

1.1仪器Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司，DAD检测器)；Delsa Nano C电位/纳米粒度分析仪(美国Beckman Coulter公司)；JY88-IIN型超声波细胞破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；JEM-100CXII透射电镜(日本电子株式会社)；CP 225 D型电子分析天平(德国赛多利斯公司)；TGL-20000-CR型高速台式冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；超滤离心管(截留相对分子质量10 kD，美国Millipore公司)。

1.2试药 芦丁原料药(质量分数99.0%，LOT: R106911，湖北兴银河化工有限公司)；芦丁对照品(质量分数99.0%，LOT: 100802-201406，中国药品生物制品检定所)；大豆卵磷脂(德国Lipoid公司)；硬脂酸(广东达濠化工厂)；聚山梨酯-80(天津市大茂化学试剂厂)；聚乙二醇-400(广东汕头市西陇化工厂)。

2方法与结果

2.1芦丁固体脂质纳米粒的制备精密称取一定量的芦丁、硬脂酸和大豆卵磷脂，置于圆底烧瓶中，加入适量甲醇超声使其溶解，于70 ℃旋转蒸发，使其形成均匀薄膜层。加入同温度下一定体积分数的聚乙二醇-400溶液5 mL和聚山梨酯-80 5 mL，超声20 min使薄膜层与水相充分混合。冰水浴下以细胞破碎仪超声分散(功率400 W，3 s)60次，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得芦丁固体脂质纳米粒混悬液，4 ℃保存备用。

2.2 芦丁固体脂质纳米粒含量测定

2.2.1色谱条件 色谱柱：Kromasil 100-5 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇-冰醋酸溶液(35∶65)为流动相；检测波长：257 nm；柱温：30℃；流速：1 mL·min-1；进样量：10 μL。

2.2.2 线性考察 精密称取12.11 mg芦丁对照品，置于100 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，涡旋混匀，得质量浓度为121.1 μg·mL-1的储备液。精密量取储备液适量，分别用甲醇稀释成质量浓度为6.055，12.11，24.22，48.44，72.66，96.88和108.99 μg·mL-1的系列对照品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样测定，以峰面积(A)与质量浓度(C)进行线性回归。得回归方程：A=49.628C+1.467 8(r=0.999 5)。结果表明，药物质量浓度在6.055~108.99 μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。

2.2.3 专属性实验 分别以对照品、样品和空白固体脂质纳米粒混悬液进样测定，记录色谱图，处方中辅料对样品测定无干扰。

2.2.4 重复性实验 精密量取1 mL芦丁固体脂质纳米粒混悬液，按2.2.8项下方法平行配制6份供试品溶液，依法测定，计算含量。测得平均含量为99.86 μg·mL-1，RSD为0.43 %。表明该方法重复性良好。

2.2.5 精密度实验 取2.2.4项下同一供试品溶液，连续重复进样6次，记录峰面积，测得RSD为0.34%，表明该方法精密度良好。

2.2.6 稳定性实验 取2.2.4项下制备的同一供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，12，24，36，48，60和72 h进样测定，测得峰面积RSD为 1.39%，表明供试品溶液在72 h内稳定。

2.2.7 回收率实验 精密量取3份2.2.4项下同一批芦丁固体脂质纳米粒混悬液0.5 mL，置于10 mL量瓶中，分别加入121.1 μg·mL-1的对照品溶液0.3，0.4和0.5 mL，按2.2.8项下方法平行配制供试品各3份，滤过，取续滤液按2.2.1项下色谱条件进样测定，计算平均回收率为98.28% ，RSD为1.23%。

2.2.8 含量测定 分别精密量取3批芦丁固体脂质纳米粒混悬液各1 mL，加甲醇溶解并超声5 min(100 W)，定容至10 mL，滤过，取续滤液按2.2.1项下色谱条件进样测定。另取芦丁对照溶液，同法进样测定。按外标法计算，得3批供试品的含量分别为 99.86，103.11和101.21 μg·mL-1。

2.3芦丁固体脂质纳米粒包封率测定采用超滤离心法[9]测定芦丁固体脂质纳米粒混悬液的包封率，精密量取芦丁固体脂质纳米粒混悬液1 mL，置于Millipore超滤离心管中，以5 000 r·min-1离心15 min，以甲醇溶解沉淀并超声破坏，定容至10 mL，按2.2.1项下色谱条件进样测定包裹在脂质纳米粒中的芦丁含量M1；另取芦丁固体脂质纳米粒混悬液1 mL，加入甲醇超声破坏并定容至10 mL，滤过，取续滤液按2.2.1项下色谱条件进样测定脂质纳米粒中总含药量M总。

包封率(%)=M1/M总×100%

2.4 处方筛选 单因素考察发现，硬脂酸用量、聚山梨酯-80质量浓度、聚乙二醇-400体积分数、大豆卵磷脂用量对芦丁固体脂质纳米粒的成型、粒径、电位、包封率和释放均有较大影响，因此，以硬脂酸用量(A)、聚山梨酯-80质量浓度(B)、聚乙二醇-400体积分数(C)、大豆卵磷脂用量(D)作为处方优化考察因素，每个因素选择3个水平，以包封率为指标，采用正交实验设计优化处方，以正交表L9(34)设计实验，因素水平见表1，实验方法及结果见表2，方差分析见表3。

表1 因素水平表

Tab.1 The factors and levels

水平因 素A,硬脂酸用量/mgB,聚山梨酯-80质量浓度/mg·mL-1C,聚乙二醇-400体积分数/%D,大豆卵磷脂用量/mg15085502100101010031501515150

表2 处方优化正交实验结果

Tab.2The results of the orthogonal design

实验号因素ABCD包封率/%150855048.01250101010063.21350151515069.26410081015076.39510010155069.48610015510085.34715081510080.16815010515076.22915015105070.96K1180.48204.56209.57188.45K2231.21208.91210.56228.71K3227.34225.56218.90221.87R50.7321.009.3340.26

表3方差分析结果

Tab.3 The results of variance analysis

因素偏差平方和自由度均方平方和F比F临界值显著性优选方案A531.602265.8030.36*A2B81.90240.954.68F0.05(2,2)=19.0B3C17.5128.751.00F0.10(2,2)=9.0C3D309.392154.7017.67D2

由正交实验及方差分析结果可知：选择偏差平方和最小的因素C作为误差项，对芦丁固体脂质纳米粒包封率影响大小顺序为：A>D>B>C，因素A对芦丁固体脂质纳米粒包封率的影响有显著性意义(P>0.05)。单因素考察中发现，聚乙二醇-400的体积分数越小，芦丁缓释效果越好，因此，采用聚乙二醇-400体积分数为5%，结合正交实验结果分析，优化搭配为A2B3C1D2，此优化搭配与实验方案中包封率最高的第6号实验的水平组合一致。

2.5 优化处方的验证实验 由正交实验优选的芦丁固体脂质纳米粒最佳处方，即芦丁10 mg、硬脂酸100 mg、聚山梨酯质量浓度15 mg·mL-1、聚乙二醇-400体积分数5%、大豆卵磷脂100 mg，按2.1项下方法平行制备3批芦丁固体脂质纳米粒混悬液，以粒径、包封率对最佳处方进行验证，验证结果见表4。

表4 验证实验结果

Tab.4 The results ofvalidation test

批号123平均值RSD%粒径/nm198.30196.70191.80195.601.74包封率/%83.2187.3986.3385.642.54

由验证实验结果证明，通过正交设计得到的最佳条件其验证值和计算值无显著性差异，表明此处方工艺稳定。

2.6芦丁固体脂质纳米粒性质考察

2.6.1 外观形态 采用透射电镜观察芦丁固体脂质纳米粒的形态。方法为取适量样品溶液滴加到专用铜筛网上，用20 g·L-1磷钨酸染色，用滤纸吸去多余的液体，自然干燥后置于透射电镜下，观察并拍摄照片。发现芦丁固体脂质纳米粒呈均一球形，粒子分布均匀，结果见图1。

图1芦丁固体脂质纳米粒透射电镜图

Fig.1 The TEM of RT-SLNs

2.6.2粒径及Zeta电位 取一定量芦丁固体脂质纳米粒混悬液，用蒸馏水适当稀释，采用电位/纳米粒度分析仪测定粒径分布及电位，结果芦丁固体脂质纳米粒的平均粒径为195.8±11 nm，多分散性系数PI为0.12±0.03， Zeta电位为-20.65±0.6 mV。结果见图2和图3。

图2粒径分布图

Fig.2 The particls size distribution

图3Zeta电位分布图

Fig.3 The Zeta potential of RT-SLNs

由图4可知，芦丁固体脂质纳米粒混悬液可以延长药物的释放，具有一定的缓释效果，72 h释放总药量为87.32%。作为对比的芦丁混悬液在24 h内已经释放总药量的85%，48 h内几乎释放完全。

图4 RT-SLN释药曲线

Fig.4 The release profile of RT-SLNs

3 讨论

固体脂质纳米粒的制备方法很多，主要有高压乳匀法、溶剂扩散法、微乳液法、薄膜超声分散法和高温乳化-低温固化法等[10-11]。本研究结合实验室条件采用薄膜-超声法制备芦丁固体脂质纳米粒，并对按最优处方制备的纳米粒的外观形态、粒径、电位、包封率、体外释药特性进行评价，表明薄膜-超声法适合制备芦丁固体脂质纳米粒。

由于芦丁脂溶性和水溶性都较差，正交设计优化处方中考察了不同质量浓度的聚山梨酯-80和聚乙二醇-400作为乳化剂增加芦丁的溶解度，形成脂质纳米粒的过程中聚山梨酯-80、聚乙二醇-400和大豆卵磷脂形成一层包裹硬脂酸的膜，芦丁可以浓集在这层乳化膜内，有效提高芦丁固体脂质纳米粒的包封率。正交设计优化处方所制备的芦丁固体脂质纳米粒，平均包封率为86.31%，平均粒径为195.8±11 nm。脂质纳米粒具有巨大的比表面积，可显著改善芦丁在消化液中的溶解度；具有较小的粒径、良好的生物相容性，脂溶性高，能较好地黏附于胃肠道壁，延长药物在胃肠道停留时间，增加芦丁的吸收。

芦丁固体脂质纳米粒混悬液释药过程包括快释和慢释两部分，前12 h属于快释过程，释放了全部药量约40.41%，这是由于芦丁固体脂质纳米粒中游离的芦丁和吸附在纳米粒表面的芦丁，在漏槽的条件下导致药物发生快释过程。随着纳米粒两侧质量浓度差的增大，骨架型的固体脂质纳米粒缓慢释放，72 h时，其累积释放率达到87.32%。

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