干细胞标志Lgr5在糖尿病小鼠小肠上皮中的表达

作者单位：510120 广州，中山大学孙逸仙纪念医院消化内科

干细胞标志Lgr5在糖尿病小鼠小肠上皮中的表达

钟献阳于涛黎洁瑶杨洪生欧阳慧陈其奎

【摘要】目的探讨糖尿病小鼠小肠上皮干细胞标志分子G蛋白偶联受体5(Lgr5)的表达及干细胞数量的改变情况。方法采用链脲佐菌素腹腔注射的方法建立糖尿病小鼠模型，用免疫组织化学检查(免疫组化)检测糖尿病小鼠(6只)与正常小鼠(6只)小肠上皮组织中Lgr5的表达，并分离糖尿病小鼠与正常小鼠原代小肠上皮细胞，采用流式细胞技术测定Lgr5阳性细胞在上皮细胞中的比例。结果免疫组化结果显示糖尿病与正常小鼠小肠上皮每个隐窝单位的Lgr5阳性细胞数量分别为(3.7±0.5)个及(1.5±0.6)个，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞技术测得糖尿病与正常小鼠小肠上皮Lgr5阳性细胞比例分别为(28.75±3.69)%及(6.55±1.78)%，前者上皮组织中Lgr5阳性细胞比例显著高于后者(P<0.05)。结论链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠小肠上皮Lgr5阳性干细胞数量增加，Lgr5在糖尿病小鼠小肠上皮细胞高表达。

【关键词】G蛋白偶联受体5；糖尿病；小肠上皮干细胞；原代细胞分离

DOI:10.3969/g.issn.0253-9802.2015.05.004

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81370475)

通讯作者，于涛，E-mail: yutao2014@126.com

收稿日期：(2015-01-15)

Expression of the stem cell marker Lgr5 in the small intestinal epithelium of diabetic miceZhongXianyang,YuTao,LiJieyao,YangHongsheng,OuyangHui,ChenQikui.DepartmentofGastroenterology,SunYat-senMemorialHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China

Correspondingauthor,YuTao,E-mail:yutao2014@126.com

Abstract【】ObjectiveTo measure the expression of the stem cell marker leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5 (Lgr5) in the small intestinal epithelium and investigate the changes in the quantity of stem cells in the diabetic mice. MethodsDiabetic mouse model was established by intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ). The expression levels of Lgr5 in small intestinal epithelial tissues of the diabetic (n=6) and normal mice (n=6) were assessed by immunohistochemistry. Primary intestinal epithelial cells were isolated from the diabetic and normal mice and the percentage of Lgr5-positive cells among epithelial cells were assessed by flow cytometry. ResultsImmunohistochemical analysis revealed that the quantity of Lgr5-positive cells per crypt in the diabetic and normal mice was (3.7±0.5) and (1.5±0.6) with statistical significance (P<0.05). Flow cytometry demonstrated that the percentage of Lgr5-positive cells in the intestinal epithelial cells of the diabetic mice was (28.75±3.69)%, significantly higher compared with (6.55±1.78)% of the normal mice (P<0.05). ConclusionsThe quantity of Lgr5-positive stem cells in the small intestinal epithelium of the STZ-induced diabetic mice was increased. Lgr5 was highly expressed in the small intestinal epithelium of the diabetic mice.

【Key words】Lgr5; Diabetes mellitus; Small intestinal epithelial stem cell; Isolation of primary cell

糖尿病肠病是糖尿病常见并发症之一，患者的肠道神经-内分泌-免疫的正常结构和功能受影响，同时伴有胃肠调节功能受损。本病主要临床表现为顽固性腹泻、水样便，或腹泻与便秘交替出现，其确切发病机制尚未完全明确[1]。哺乳动物的小肠黏膜上皮是机体营养物质吸收的主要场所，肠黏膜上皮终生进行着不间断的自我更新，这依赖于位于肠道隐窝部位的干细胞不断增值及分化来实现[2]。本研究组新近报道，糖尿病小鼠的小肠上皮存在增殖过度的现象，提示小肠干细胞的状态发生了改变[3]。富含亮氨酸重复序列G蛋白偶联受体5(Lgr5)是小肠干细胞标志分子，本研究旨在通过在体研究及分离原代肠上皮细胞组分，探讨糖尿病小鼠与正常小鼠小肠上皮之间是否存在Lgr5阳性干细胞数量的差异，为后续研究干细胞功能提供参考数据。

材料与方法

一、主要试剂

链脲菌素购自Sigma公司；柠檬酸购自广州化学试剂厂；兔抗小鼠Lgr5抗体购于Santa Cruz公司；免疫组织化学检查(免疫组化)SP试剂盒购于迈新公司；中性蛋白酶Ⅰ和胶原酶Ⅺ购于Sigma公司；藻红蛋白标记的二抗购于中杉金桥公司；组织分散液以DMEM液含5%胎牛血清和2%山梨醇配制。

二、实验动物

实验动物为C57BL/6J小鼠，共12只，均为雌性，鼠龄6～8周，购于中山大学北校区实验动物中心，在中山大学北校区实验中心屏障环境中饲养。所有有关动物的实验过程均在中山大学实验动物伦理委员会的监督指导下完成，符合实验动物伦理学要求。

三、实验方法

1.糖尿病小鼠模型的建立

将12只C57BL/6J 小鼠随机分为2组各6只，其中一组作为糖尿病组进行建模，另一组为正常对照组。用无菌0.1 mol/L柠檬酸缓冲液(pH=4.5)溶解链脲菌素粉剂制成1%链脲菌素液，予糖尿病组腹腔内注射新鲜配制的1%链脲菌素溶液，剂量为70 mg/kg，1次/日，连续5 d。对照组给予相同体积的无菌0.1 mol/L 柠檬酸缓冲液腹腔内注射，1次/日，连续5 d。小鼠血糖大于16.7 mmol/L 并持续维持在该水平以上则为糖尿病模型建模成功[4-5]。于腹腔注射后第10周处死2组小鼠，沿腹部正中线行切口，取出靠近空肠10 cm片段进行后续免疫组化及流式细胞技术检测。

2.免疫组化检测小肠上皮Lgr5的表达

将甲醛固定的小肠组织进行石蜡包埋，制备组织切片。切片组织经常规脱蜡水化，过氧化酶阻断剂轻摇孵育10 min，非免疫羊血清孵育10 min，Lgr5一抗(1∶250稀释)4℃孵育过夜，二抗37℃孵育30 min，链霉素抗生物素-过氧化物酶(SP)孵育10 min，二氨基联苯胺显色5 min，磷酸盐缓冲液终止显色，苏木素复染30 s，常规脱水、封片后置于显微镜下观察。光镜下观察Lgr5阳性细胞的位置及表达情况，以在细胞膜及细胞质中出现棕黄色颗粒为Lgr5阳性表达。由2位医师在不知小鼠的来源及分组的情况下阅片，在400倍的观察条件下，计算视野中每个完整小肠隐窝单位lgr5阳性细胞的数目。随机选择15个视野计数分析，综合后取其平均值。

3.原代小肠上皮细胞分离

在解剖镜下仔细去除剖腹取出的小肠肠系膜。用清洗液冲洗肠管，再用眼科剪沿小肠纵轴剪开肠管，用无菌D-Hanks液清洗7～8遍。将肠管剪成1 mm3大小的碎块，加入酶消化液(0.1 mg/ml中性蛋白酶Ⅰ和300 U/ml胶原酶Ⅺ)37℃振荡消化25 min，随后1 000 r/min离心5 min，弃上清液。加入无菌D-Hanks液，1 000 r/min离心5 min，弃上清液。加入10 ml组织分散液，吹打均匀，静置1 min，收集上清液，置于试管中，重复该步骤4次。将收集的上清液300 r/min离心3 min，沉淀重悬于10 ml组织分散液中，重复该步骤3次。最后，沉淀重悬液为所分离的小肠上皮细胞，在倒置显微镜下进行观察[6]。

4.流式细胞技术检测糖尿病小鼠原代小肠上皮细胞中Lgr5阳性细胞的比例

将分离的小肠上皮细胞组分继续用胰酶在室温下消化3 min，用磷酸盐缓冲液洗净后以20 μm细胞过滤网过滤。随后用磷酸盐缓冲液调整细胞浓度为1×106个/ml。加兔抗小鼠的Lgr5抗体(1∶100稀释)在室温下孵育1 h，阴性对照组同时加入等量的磷酸盐缓冲液代替一抗，用磷酸盐缓冲液洗3次后加入藻红蛋白标记的山羊抗兔二抗(1∶200稀释)避光孵育45 min。细胞重悬为浓度1×106个/ml后取200 μl于EPICS ALTRA流式细胞仪检测带藻红蛋白荧光的细胞的比例，即Lgr5阳性细胞比例。

四、统计学处理

结果

一、免疫组化结果

免疫组化结果显示，Lgr5分子主要表达在阳性细胞的胞浆及胞膜，呈黄色或棕黄色颗粒(图1A)。Lgr5阳性细胞主要位于小肠隐窝底部，靠近潘氏细胞。糖尿病组小肠上皮平均每个隐窝单位的Lgr5阳性细胞数量为(3.7±0.5)个，正常对照组为(1.5±0.6)个，2组间比较差异有统计学意义(图1B，t=2.532、P=0.028)。

图1　Lgr5在糖尿病组和正常对照组小鼠小肠上皮组织的表达

A：Lgr5在糖尿病组和正常对照组小鼠小肠上皮组织的免疫组化图，Lgr5主要表达于细胞质与细胞膜，黑色箭头示Lgr5阳性细胞(SP法,×400)；B：糖尿病组小肠上皮每个隐窝单位的Lgr5阳性细胞数量显著高于正常对照组，*为P< 0.05

二、流式细胞技术检测结果

采用中性蛋白酶Ⅰ和胶原酶Ⅺ联合消化法分离到的小肠上皮细胞组分中含有大量单个细胞及隐窝细胞团(图2A)。流式细胞技术的检测结果显示，原代分离的糖尿病小鼠小肠上皮细胞中Lgr5阳性细胞比例为(28.75± 3.69)%；正常小鼠小肠上皮细胞中Lgr5阳性细胞比例为(6.55± 1.78)%，两者比较差异有统计学意义(图2B、C，t=3.079、P=0.017)。糖尿病组小肠上皮细胞中Lgr5阳性细胞比例显著高于正常对照组。

图2　糖尿病组与正常对照组小鼠小肠上皮Lgr5阳性细胞比例

A：分离的糖尿病与正常小鼠原代小肠上皮细胞组分，可见大量的上皮细胞及典型的“毛虫样”隐窝结构(光镜下直接观察，×200)；B：流式细胞技术检测糖尿病组与正常对照组小鼠小肠上皮带藻红蛋白荧光的Lgr5阳性细胞(上为糖尿病组，下为正常对照组)；C：流式细胞技术检测发现糖尿病组较正常对照组小肠上皮Lgr5阳性细胞比例高，*为P< 0.05

讨论

糖尿病肠病是糖尿病患者常见并发症之一，发病率为10%～20%。除具备糖尿病多饮、多食、多尿、消瘦等一般表现外，其特征性表现是肠道功能障碍，顽固性、无痛性腹泻和吸收不良，稀便或呈水样便等，其发病机制可能为内脏神经疾患、肠道菌群失调、肠道激素分泌紊乱及胆汁酸吸收障碍等，具体机制尚未完全阐明。此外，Zhao等[7]观察到糖尿病小鼠的小肠明显较正常小鼠厚，小肠的湿重及绒毛长度都大于正常小鼠。Peeters等[8-9]发现糖尿病患者罹患肠道肿瘤的风险大大增加。这些均提示糖尿病患者不仅出现肠道一般功能的改变，其肠上皮增殖过程中也可能存在异常。

小肠上皮干细胞通过不断自我更新的方式来实现增殖，干细胞在这一过程中逐渐分化为各种肠上皮细胞而组成了隐窝及肠绒毛结构，这也是肠上皮新陈代谢的机制。目前认为，肠隐窝是单克隆的，每一隐窝都起源于各自的干细胞，干细胞通过不对称分裂有规律地产生短暂增殖细胞，从而分化为各个类型的成熟小肠上皮细胞。在过去10年中，许多肠上皮干细胞标志分子被相继提出，Lgr5是新近研究的标志分子。Lgr5是G蛋白偶联受体家族的成员之一，Koo等[10]发现Lgr5在小肠隐窝基底柱状细胞中高表达，体外培养进一步发现Lgr5阳性的小肠隐窝基底柱状细胞能形成所有类型的小肠上皮细胞，证明Lgr5是小肠上皮干细胞的特异性标志分子，这一推测已被业内广泛验证和接受。

本实验组对糖尿病小鼠血糖升高后不同时间点的肠上皮结构进行了研究，发现第10周小肠上皮湿重增加、绒毛-隐窝高度增加，同时出现增殖过度及上皮的分化异常[3]。因此，本次研究以本实验组的既往报道为基础，采用Lgr5作为肠上皮干细胞的标志分子，采用免疫组化检测糖尿病小鼠与正常小鼠小肠组织中Lgr5蛋白的表达情况，结果示Lgr5主要定位于小肠隐窝基底部，同时，糖尿病小鼠小肠上皮每个隐窝的Lgr5阳性细胞数量显著高于正常小鼠。由于Lgr5为跨膜蛋白，在细胞膜表面存在免疫原性，为进一步验证免疫组化的结果，我们采用流式细胞技术进一步测定糖尿病与正常小鼠小肠上皮细胞中Lgr5阳性细胞的比例。在这一实验过程中，我们用中性蛋白酶Ⅰ和胶原酶Ⅺ联合消化法分离小鼠小肠上皮细胞，该方法不仅能获得较纯的小肠上皮细胞，而且对细胞的损伤作用小，有利于后续流式细胞仪的分析[11]。本研究的流式细胞技术检测结果示，糖尿病小鼠小肠上皮Lgr5阳性细胞比例显著高于正常小鼠。免疫组化及流式细胞技术的检测结果均表明糖尿病小鼠小肠上皮中Lgr5阳性干细胞的数量明显增加，提示Lgr5阳性干细胞的状态改变与糖尿病小肠上皮改变的发生或者发展相关。

作为干细胞的分子标志物，Lgr5阳性细胞在糖尿病小鼠小肠上皮中的比例和数量增加，提示小肠上皮处于增殖活跃状态，这与糖尿病状态下的小肠较正常对照状态湿重增加相吻合。Nakata等[12]的研究示Lgr5在包括结肠癌的多种肿瘤组织中高表达，显示出Lgr5阳性干细胞的改变可能与肿瘤的发生、发展也有关系。Lgr5阳性干细胞在糖尿病小鼠小肠上皮中数量增加在一定程度上也提示了糖尿病可能与肠道肿瘤相关的原因。增多的Lgr5阳性细胞可能作为肿瘤干细胞的来源，或者引起肠黏膜的快速更新或分化不良，导致糖尿病患者肠道肿瘤的高发。这一假设还需要在今后的工作中作进一步研究加以验证。

综上所述，糖尿病小鼠小肠上皮中Lgr5阳性干细胞数量增加，提示Lgr5阳性干细胞的状态改变与糖尿病小肠上皮改变存在一定的相关性。

参考文献

[1]Rodrigues ML, Motta ME. Mechanisms and factors associated with gastrointestinal symptoms in patients with diabetes mellitus. J Pediatr (Rio J), 2012, 88(1):17-24.

[2]Tan DW, Barker N. Intestinal stem cells and their defining niche. Curr Top Dev Biol, 2014, 107:77-107.

[3]Min XH, Yu T, Qing Q, Yuan YH, Zhong W, Chen GC, Zhao LN, Deng N, Zhang LF, Chen QK. Abnormal differentiation of intestinal epithelium and intestinal barrier dysfunction in diabetic mice associated with depressed Notch/NICD transduction in Notch/Hes1 signal pathway. Cell Biol Int, 2014, 38(10): 1194-1204.

[4]杨薇, 黎小妍, 刘玉兴, 张立建，钱兴国. 辛伐他汀对糖尿病大鼠血脂和血小板膜糖蛋白表达水平的影响. 新医学, 2014, 45(4):236-239.

[5]闵筱辉, 陈其奎, 于涛, 周慧敏. 链脲佐菌素诱导建立长期稳定糖尿病小鼠模型的给药方案研究. 中国医药导报, 2013, 10(4):7-10.

[6]Campbell CF. Isolation and culture of mouse intestinal cells. Methods Mol Biol, 2010, 633:197-206.

[7]Zhao J, Chen P, Gregersen H. Morpho-mechanical intestinal remodeling in type 2 diabetic GK rats--is it related to advanced glycation end product formation. J Biomech, 2013, 46(6):1128-1134.

[8]Peeters PJ, Bazelier MT, Leufkens HG, de Vries F, De Bruin ML. The Risk of Colorectal Cancer in Patients With Type 2 Diabetes: Associations With Treatment Stage and Obesity. Diabetes Care, 2015, 38(3):495-502.

[9]Rasool S, Kadla SA, Rasool V, Ganai BA. A comparative overview of general risk factors associated with the incidence of colorectal cancer. Tumour Biol, 2013, 34(5):2469-2476.

[10]Koo BK, Clevers H. Stem cells marked by the R-spondin receptor LGR5. Gastroenterology, 2014, 147(2):289-302.

[11]纪华英, 陈其奎, 曾晖. 小鼠小肠上皮细胞的体外培养. 医学综述, 2010, 16(9):1417-1419.

[12]Nakata S, Phillips E, Goidts V. Emerging role for leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptors LGR5 and LGR4 in cancer stem cells. Cancer Manag Res, 2014, 6:171-180.

(本文编辑：洪悦民)

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