响应曲面优化秸秆稀酸水解工艺用于发酵产壳聚糖

响应曲面优化秸秆稀酸水解工艺用于发酵产壳聚糖

徐晴1，袁瀚2，杨平2，周军2，李霜1

(1.南京工业大学生物与制药工程学院，江苏南京211800；

2.国家固态酿造工程技术研究中心，四川泸州646000)

摘要：为实现利用秸秆水解产生的五碳糖发酵产壳聚糖，以米根霉为研究对象，研究水解温度、水解时间、酸浓度等不同预处理方式获得的半纤维素水解液对米根霉发酵产壳聚糖的影响。结果表明：水解温度、水解时间对水解液中木糖含量以及甲酸、乙酸、糠醛等抑制剂浓度具有显著影响，并进一步影响后续发酵产壳聚糖的生成量。利用响应曲面对稀酸水解预处理条件进行优化，获得最佳工艺条件：H2SO4 13.6 g/L，99.5 ℃，水解时间1.91 h，在此条件下预测壳聚糖发酵产量为0.79 g/L，实验验证产量为0.82 g/L，占菌体生物量的15%～18%。研究结果为秸秆资源的高效利用及发酵生产壳聚糖提供新思路。

关键词：米根霉；半纤维素；木糖；壳聚糖；抑制剂

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2015.06.001

收稿日期：2014-07-14

基金项目：国家固态酿造工程技术研究中心开放课题(GCKF201112)；国家高技术研究发展计划(863计划)(2012AA022304)

作者简介：徐晴(1983—)，女，江苏苏州人，助理研究员，硕士，研究方向：微生物代谢调控；李霜(联系人)，教授，E-mail:lishuang@njtech.edu.cn

中图分类号：TQ352

文献标志码：A

文章编号：1672-3678(2015)06-0001-05

Abstract：To optimize the usage of hemicellulose hydrolysate(HH) for chitosan production,the effect of different pretreatment condition of hemicellulose on chitosan production by Rhizopus oryzae was studied.The results showed that high temperature and/or long reaction time had significant effect on the concentration of xylose and inhibitors(formic acid,acetic acid,furfural),resulting influence in chitosan production. Through the quadratic model analyzed by response surface methodology(RSM),the optimal pretreatment condition of hemicellulose for chitosan production was 99.5 ℃,H2SO4 13.6 g/L,1.91 h. Under this condition,chitosan production could reach 0.82 g/L,which was a little higher than the predict value of model (0.79 g/L),and account for 15%-18% of the biomass. The present study would provide a potential route for lignocellulose utilization and chitosan production.

Keywords：Rhizopus oryzae;hemicelluloses;xylose;chitosan;inhibitor

Optimal pretreatment conditions of corn straw for chitosan production by Rhizopus oryzae

XU Qing1,YUAN Han2,YANG Ping2,ZHOU Jun2,LI Shuang1

(1.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China;

2.National Engineering Research Center of Solid-State Brewing,Luzhou 646000,China)

木质纤维素是地球上储量最丰富的生物质可再生资源，广泛来源于农林废弃物(如玉米秸秆、酒糟、废木屑等)，它主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，其中半纤维素组分约占20%～35%。利用稀酸水解法对木质纤维素进行预处理，不仅能降解半纤维素组分，还为后续酶解反应提供了较为疏松的底物结构，提高酶解效果。半纤维素组分的水解产物主要以木糖为主，水解过程中伴生的甲酸、乙酸、糠醛等副产物对多数微生物具有强抑制作用，限制了酸解产物的生物利用。

壳聚糖广泛存在于甲壳类动物外骨骼和真菌细胞壁，是一种高附加值的聚合物，具有良好的生物可降解性、生物相容性，被广泛应用于化工、医药等行业。利用根霉属、毛霉属等真菌发酵法制备的壳聚糖脱乙酰度较高，具有很高的应用价值，是壳聚糖产业的重要发展方向之一。窦畅等在前期研究中发现米根霉能高效利用木糖积累生物量，尤其利用秸秆酸解所产的木糖组分时，细胞壁中壳聚糖含量较高，且酸液中的甲酸、糠醛等“抑制物”在一定浓度下有利于壳聚糖的积累，因此秸秆酸解液有望成为优良的壳聚糖发酵原料。

笔者利用响应曲面设计优化半纤维素的酸解预处理工艺，建立秸秆酸解条件与米根霉发酵生产壳聚糖的直接关系，以获取最适宜于壳聚糖发酵的秸秆酸解预处理工艺。

1材料与方法

1.1　菌株

菌种为米根霉(RhizopusoryzaeME-F12)，南京工业大学代谢工程实验室保藏。

1.2　玉米秸秆的酸解处理

将玉米秸秆研磨至粒径不超过1 mm的颗粒，按固液比为1∶10(g/mL)加不同浓度H2SO4进行酸解反应，然后加Ca(OH)2调节pH至8.0，过滤后得到的清液即为半纤维素水解液。考察水解温度(X1，℃)、H2SO4质量浓度(X2，g/L)和水解时间(X3，h)3个因素对酸解效果的影响，以发酵壳聚糖产量(Y1，g/L)为响应指标，利用statistical software package(Stat-Ease Inc.,USA)软件进行中心复合设计(central composite design,CCD)，实验条件如表1所示,每组实验采用3个平行后取均值进行CCD数据分析。

1.3　培养条件

将在35 ℃培养6 d的米根霉用无菌水洗脱孢子，获得孢子悬浮液，按2%(体积分数)的接种量将孢子悬浮液接种至发酵培养基中。发酵培养基组成：秸秆酸水解液 50 mL，KH2PO40.6 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，尿素2 g/L。pH 自然。在35 ℃、200 r/min条件下培养。

表1　酸水解条件响应面设计

1.4　壳聚糖提取

壳聚糖的分析参照文献的方法。摇瓶培养获得的菌体经过滤、烘干，加入1 mol/L NaOH，使菌体含量达25 g/L，121 ℃处理15 min，冷却，10 000 r/min离心，获得碱不溶物，洗涤至中性。加入100倍体积的2% (体积分数)的乙酸，95 ℃下水解24 h，10 000 r/min离心，上清用NaOH调pH至9.0，10 000 r/min离心，水洗后分别再用乙醇、丙酮洗涤，获得壳聚糖。

1.5　酸解液组分的测定

秸秆酸解液组分测定参照文献的方法,具体测定条件：戴安P680，Chromeleon工作站，Bio-Rad Aminex HPX-87H色谱柱(300 mm×7.8 mm，9 μm)；流动相5 mmol/L H2SO4；流速0.6 mL/min；柱温60 ℃。甲酸、乙酸采用RID检测器检测，糠醛采用紫外检测器检测，波长为210 nm。

2结果与讨论

2.1　预处理条件对秸秆酸解液成分的影响

根据响应面设计(表1)的方法，对不同酸解条件下的组分进行测定，结果如表2所示。由表2可知：水解液中的主要成分是木糖为8.24～25.24 g/L，其次是葡萄糖(0.77～5.34 g/L)和阿拉伯糖(2.02～4.76 g/L)。水解液中主要的抑制物为甲酸、乙酸、糠醛。

较高的水解温度和较长的水解时间对糖的降解释放和抑制物的产生均具有一定的促进作用。使用10 g/L的H2SO4，120 ℃水解3 h(第6组实验)，得到的木糖质量浓度最大，为25.24 g/L；而当温度为80 ℃水解3 h(第2组实验)，木糖质量浓度仅为10.75 g/L；当H2SO4为30 g/L，120 ℃水解3 h(第8组实验)，糠醛质量浓度达最大值，为2.79 g/L，而当水解时间缩短为1 h(第7组实验)，糠醛为1.43 g/L。

表2　水解条件下对产物组成的影响

2.2　以壳聚糖产量为指标的响应面分析

以不同条件下预处理后获得的秸秆酸水解液作为碳源，配制培养基用于米根霉发酵制备壳聚糖，结果如图1所示。由图1可知：酸解液中木糖浓度高并不意味着壳聚糖产量高，在高木糖浓度(第6～8组实验，木糖为20.26～25.24 g/L)下，壳聚糖产量相对较低，仅为0.25 g/L左右。壳聚糖的最高产量(0.67 g/L)出现在第11组，该酸解液中木糖含量并不高，为16.32 g/L。真核微生物的细胞壁在受到外界刺激时，会改变多糖等组分以更好地适应环境。当一定浓度的甲酸、乙酸、糠醛存在时，米根霉可能通过合成更多壳聚糖等大分子聚合物增厚细胞壁，抵御抑制剂对细胞产生的危害。在第6～8组实验中，抑制剂甲酸、乙酸、糠醛质量浓度较高(1～3 g/L)，抑制剂的大量存在对微生物细胞产生了毒害作用，如甲酸会破坏细胞上的疏水位点[10]，从而影响了菌体生长和壳聚糖的合成；而第11组抑制剂组分含量有显著下降，其浓度恰好与之前研究的有效刺激浓度相符合。因此，仅以木糖浓度为指标优化秸秆酸解过程用于后续发酵是不合适的。水解过程中，抑制剂浓度的变化对后续菌体生长与壳聚糖合成的影响要大于一定范围内糖浓度变化带来的影响，因此，优化半纤维素水解用于后续发酵要更多关注抑制剂的生成情况。

图1　 半纤维素水解液培养基中米根霉菌体 生物量及壳聚糖产量 Fig.1　 Mycelia growth and chitosan production in hemicellulose hydrolysate pretreated by different conditions

为了获取最佳的秸秆酸解工艺，以壳聚糖的产量为响应指标，对各预处理条件下的实验结果进行多元回归拟合，构建响应面模型，得到壳聚糖产量对水解温度(X1，℃)、H2SO4浓度(X2，g/L)和水解时间(X3，h)的二次多项回归模型,见式(1)。

Y1=0.576 259-0.013 413X1-0.060 542X2+

0.005 525X3-0.005X1X2-0.025X1X3+

(1)

表3　三因素对壳聚糖产量影响的显著性分析

注：R2= 0.932 6; adjustedR2=0.824 1。

此外，16组实验所生成的响应面如图2、图3所示，壳聚糖生成量以图中颜色深浅来区分，颜色越深，壳聚糖浓度越高。由图2和图3可知，壳聚糖产量对于所考察的3个因素的变化趋势是一致的。随着水解温度、H2SO4浓度和水解时间的增长，壳聚糖产量呈现出先增长后减少的趋势，且壳聚糖产量的最大值落在笔者通过预实验所选取的中心点附近，表明响应面设计是成功的。

图2　 水解温度和H 2SO 4浓度对壳聚糖产量的影响 Fig.2　 Contour plot of the combined effects of sulfuric acid concentration and temperature on the chitosan production

图3　 水解温度和时间对壳聚糖产量的影响 Fig.3　 Contour plot of the combined effects of reaction time and temperature on the final chitosan production

2.3　半纤维素酸解条件优化

为获得最佳的半纤维素水解条件，求解回归方程的最大值，得到的结果为H2SO413.6 g/L，99.5 ℃水解1.91 h，此时预测获得的壳聚糖产量为0.79 g/L。按上述条件对木质纤维素进行酸解，水解液用于壳聚糖的发酵培养以验证模型的准确性。实验结果表明，在此条件下，水解液中木糖含量为20.45 g/L、乙酸为1.44 g/L、甲酸为0.61 g/L、糠醛为0.31 g/L，而此时发酵所获得的米根霉生物量为5.4 g/L，产生的壳聚糖达0.82 g/L，略高于预测值，能较好验证模型的准确性。

壳聚糖组分约占丝状真菌生物量的7%～10%左右。因此，要获得较高的壳聚糖产量，通常需要优化培养基或培养方式来提高菌体生物量[11-12]，或者添加刺激物如赤霉素、阿洛酮糖[13]等来促进细胞壁中壳聚糖的积累。以工艺优化的秸秆酸解液作为壳聚糖发酵生产的培养基料，添加尿素、磷酸盐等组分，培养后获得的壳聚糖组分占菌体生物量的15%～18% ，这表明通过控制酸解工艺条件可以控制伴生的甲酸、乙酸、糠醛等抑制物组分来有效促进壳聚糖的合成。

3结论

秸秆酸水解工艺的水解温度、水解时间、酸浓度对木糖及抑制剂(甲酸、乙酸、糠醛等)组分具有较为显著的影响，其中最利于米根霉发酵生产壳聚糖的秸秆酸水解工艺参数：13.6 g/L H2SO4在99.5 ℃下水解1.91 h。利用该条件处理获得的秸秆酸解液进行米根霉发酵生产壳聚糖，产量可达0.82 g/L，与模型预测值相近。结果表明秸秆酸解液有望成为壳聚糖发酵生产的重要原料，为秸秆等生物质资源的利用拓展了思路。

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(责任编辑荀志金)