桑叶经霜前后次生代谢产物表达差异分析

张魏琬麒，欧阳臻*，赵 明，魏 渊，邵 扬，王志万，汪 强

桑叶经霜前后次生代谢产物表达差异分析

张魏琬麒，欧阳臻*，赵 明，魏 渊，邵 扬，王志万，汪 强

（江苏大学药学院，江苏 镇江 212013）

为研究桑叶经霜采收的合理性，采用高效液相色谱-质谱法分析桑叶中黄酮类成分，并建立高效液相色谱法同时分析绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷4 个成分含量及柱前衍生化-高效液相色谱荧光检测法分析桑叶1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）含量，研究不同季节黄酮类成分、4 个单体成分及生物碱（DNJ）动态变化规律。结果表明，桑叶黄酮类成分在7、8月份气温较高时含量较低，10、11月份经霜后达最大值；DNJ在7、8月份气温较高时含量最高，9、10月份随着气温下降含量下降，经霜后更低。生物碱类成分对桑叶疏散风热、清热润肺等功效可能影响较小，桑叶经霜药用可能与黄酮类成分有关。

桑叶；次生代谢产物；高效液相色谱-质谱法；经霜；动态变化

桑叶始载于《神农本草经》，为桑科植物桑（Morus alba L.）的干燥叶，性寒、味甘苦，归肺、肝经，具有疏散风热、清肺润燥、清肝明目之功效，常用于风热感冒、肺热燥咳、头晕头痛、目赤昏花等[1]。古代就有用来“止消渴”和“明目长发”。现代药理研究认为桑叶具有降糖、降脂、抗氧化、抗肿瘤、抗菌抗炎等生物活性，其活性成分主要为黄酮类、生物碱类、苯丙素类、甾体及三萜类等次生代谢产物[2-5]。桑叶营养丰富，被国家卫生部列入“既是食品又是药品”名单，在功能性食品领域研究开发中也具有广阔前景[6]。中医历来认为冬桑叶、霜桑叶具有上乘品质，古代众多医药典籍中的桑叶也多为经霜后采收，历版《中国药典》中收录的桑叶药材也为“霜桑叶”。桑叶为何经霜后采收？药用植物在生长发育不同时期，次生代谢产物具有高度动态性[7-8]，次生代谢产物通常是中药的主要功效成分，因此植物内源性次生代谢产物动态变化及规律是研究植物功效物质的重要途径[9-10]。对不同生长季节桑叶中生物碱、黄酮、芦丁、1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）等的含量变化已有一些文献[11-12]报道，本课题组前期也对不同季节桑叶中DNJ、芦丁和多糖等成分的动态变化进行了研究[13-15]，但现有研究结果对于桑叶经霜采收的科学性与合理性尚不能科学阐释，仅选取1 种或2 种成分作为指标难以全面地反映桑叶次生代谢产物的动态变化规律以及经霜对其品质的影响。本研究采用高效液相色谱-质谱（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）法对桑叶中黄酮类成分进行分析，并建立HPLC同时测定桑叶中芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、绿原酸含量的方法，分析不同生长季节桑叶中芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、绿原酸含量；采用柱前衍生化-高效液相色谱荧光检测法[16]分析不同生长季节桑叶中生物碱（DNJ）含量，对桑叶不同生长季节和霜降前后主要次生代谢产物表达差异进行分析，为进一步阐明桑叶经霜采收的合理性及不同用途合理采收提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桑叶：2013年4—12月（10月23日为霜降）采自江苏大学桑树种植园。经江苏大学药学院欧阳臻教授鉴定为桑科植物桑的叶，低温干燥粉碎后（过40 目筛）备用。

芦丁（批号：100080-200707）、异槲皮苷（批号：111809-201001）、紫云英苷（批号：11092001）、绿原酸（批号：110753-200413） 中国食品药品检定研究院；DNJ对照品（批号：20120508） 上海原叶生物科技有限公司；乙腈（色谱纯） 德国默克公司；芴甲氧酰氯（9-fluorenylmethyl chloroformate，FMOC-Cl）美国Sigma公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

JASCO LC1500高效液相色谱系统 日本分光公司；N2000色谱工作站 浙江大学信息智能研究所；LC 2000液相色谱仪 美国安捷伦公司；LXQ线性离子阱质谱 赛默飞世尔科技公司；R-200 旋转蒸发仪 德国Büchi公司；AE240分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SHB-111循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；HHS-1恒温水浴锅 上海浦东跃新科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液的制备

1.3.1.1 混合对照品溶液的制备

分别精密称取芦丁1.3 mg、异槲皮苷1.5 mg、紫云英苷0.9 mg、绿原酸1.0 mg，置于5 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，即得混合对照品储备液（芦丁260.0 μg/mL、异槲皮苷300.0 μg/mL、紫云英苷180.0 μg/mL、绿原酸200.0 μg/mL）。精密吸取混合对照品储备液1 mL，逐级稀释，得一系列不同质量浓度的混合对照品溶液，备用。

1.3.1.2 DNJ对照品溶液的制备

精密称取干燥至恒质量的DNJ对照品1.52 mg，置10 mL容量瓶中，蒸馏水定容制得质量浓度为152 μg/mL的DNJ对照品母液。用蒸馏水将152 μg/mL的DNJ对照品母液稀释成76、38、19、9.5 μg/mL的对照品溶液系列，备用。

1.3.2 供试品溶液的制备

1.3.2.1 桑叶黄酮类成分供试品溶液的制备

精密称取1 g干燥至恒质量的桑叶粉末，加甲醇50 mL，加热回流30 min，滤过，药渣再同法提取2 次，合并滤液，减压回收溶剂，残渣用甲醇溶解并转移至50 mL容量瓶，甲醇定容。以0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

1.3.2.2 DNJ供试品溶液的制备[16]

精密称取0.2 g干燥的桑叶粉末，置于10 mL的离心管中，加入10 mL 0.05 mol/L盐酸溶液，涡旋提取30 s后离心15 min，取上清液，药渣再次加10 mL 0.05 mol/L盐酸溶液，同法重复提取1 次，合并2 次提取液，转移至50 mL容量瓶，加蒸馏水定容。

衍生化过程：取待测样品溶液10 μL置1.5 mL离心管中，加入硼酸缓冲溶液（pH 8.5）10 μL，加入5 mmol/L FMOC-Cl的衍生化试剂20 μL，混匀后水浴20 ℃反应20 min后，加入10 μL 0.1 mol/L甘氨酸溶液，最后加入950 μL体积分数0.1%醋酸溶液。混匀后以0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

1.3.3 色谱及质谱条件

1.3.3.1 黄酮类成分色谱条件

色谱柱：KromasilC18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、ODS3预柱（10 mm×4.6 mm，5 μm）；HPLC-MS定性分析：流动相为乙腈（A）-0.8%醋酸水溶液（B）；HPLC定量分析：流动相为乙腈（A）-0.5%磷酸水溶液（B）；均为梯度洗脱：0～5 min为11%A，5～10 min为11%～13.5%A，10～17 min为13.5%A，17～19 min为13.5%～19%A，19～33 min为19%～20%A，33～40 min为20%～30%A；流速0.8 mL/min；柱温30 ℃；紫外检测器检测波长358 nm；进样量20 μL。

1.3.3.2 质谱条件

电喷雾离子源，负离子模式；鞘气流速10.5 L/min；辅助气1.5 L/min；喷雾电压4.5 kV；毛细管温度325.00 ℃；毛细管电压-30.00 V；透镜电压-120.00 V；质量扫描范围m/z 100.00～1 200.00。

1.3.3.3 生物碱类成分（DNJ）色谱条件

色谱柱：HiQSiLC18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%醋酸（50∶50，V/V）；流速1 mL/min；柱温25 ℃；荧光检测器激发波长254 nm、发射波长322 nm；进样量10 μL。

1.3.4 方法学考察

1.3.4.1 精密度实验

精密吸取同一混合对照品溶液20 μL，按1.3.3.1节色谱条件重复测定6 次，记录峰面积。精密吸取同一DNJ对照品溶液10 μL，按1.3.3.3节色谱条件重复测定6 次，记录峰面积，计算峰面积的相对标准偏差（relative sandard deviation，RSD），考察仪器的精密度。

1.3.4.2 重复性实验

分别取同一桑叶样品1 g共6 份，精密称定，按1.3.2.1节方法制备供试品溶液，按1.3.3.1节方法测定，记录峰面积。分别取同一桑叶样品0.2 g共6 份，精密称定，按1.3.2.2节方法制备供试品溶液，按1.3.3.3节方法测定，记录峰面积，计算RSD，考察其重复性。

1.3.4.3 稳定性实验

取同一黄酮供试品溶液分别于0、2、4、8、12、24 h不同时间点进样测定，记录峰面积。取同一DNJ供试品溶液分别于0、2、4、8、12、24 h不同时间点进样测定，记录峰面积，计算RSD，考察其稳定性。

1.3.4.4 加样回收率实验

精密称取已知含量的桑叶样品共6 份，分别精密加入芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、绿原酸对照品溶液适量，按1.3.2.1节方法制备供试品溶液，按1.3.3.1节方法测定，由回归方程计算样品中绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷含量。

精密称取已知含量的桑叶样品共6 份，分别加入DNJ对照品溶液适量，按1.3.2.2节方法制备供试品溶液，按

1.3.3.3 节方法测定，由回归方程计算DNJ的含量。

1.3.5 不同生长季节桑叶中各次生代谢产物含量测定

将不同季节桑叶样品按1.3.2.1、1.3.2.2节方法制备成供试品溶液，按1.3.3.1、1.3.3.3节色谱条件进样分析，由回归方程计算样品中绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、DNJ各种成分含量。

1.3.6 气温与黄酮类成分、生物碱类成分含量间的相关性分析

以每日的平均气温作图，得不同日期平均气温的变化趋势图。采用SPSS 20.0软件进行平均气温与芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、绿原酸、DNJ含量的相关性分析，考察气候温度对桑叶中各次生代谢产物表达的影响。

2 结果与分析

2.1 桑叶中黄酮类成分的HPLC-MS定性分析

桑叶样品的HPLC图和HPLC-MS总离子流图见图1。根据质谱提供的一级、二级离子碎片数据并参照相关文献[17-19]，对图谱中峰面积较大的8 个峰进行峰归属的分析，其中峰3、峰4、峰5与峰7与标准品对照保留时间得到确认。结果见表1。

图 1 桑叶样品HPLC图（A）及总离子流图（B）Fig.1 HPLC chromatogram and LC-MS total ion current chromatogram of mulberry leaf extract

表 1 HPLC-MS定性分析黄酮类成分结果Table 1 Qualitative analysis of flavonoids in mulberry leaves by HPLC-MS

2.2 HPLC法同时测定绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷含量

2.2.1 黄酮类成分HPLC测定

按1.3.3.1节色谱条件对桑叶样品进行分析，记录色谱图2。在该条件下，4 种指标性成分在样品中得到很好的分离，峰形较好。

图 2 混合对照品（A）和桑叶样品（B）HPLC图Fig.2 HPLC chromatograms of mixed reference substances (A) and real sample (B)

2.2.2 标准曲线和线性范围考察

分别取不同质量浓度的对照品溶液，按1.3.4节进样测定。以对照品质量浓度X（μg/mL）为横坐标，峰面积Y为纵坐标进行线性回归，得回归方程，结果见表2。

表 2 绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷的线性回归关系考察Table 2 Linear equations of chlorogenic acid, rutin, isoquercitrin and astragalin

2.2.3 精密度

绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷峰面积的RSD分别为1.7%、1.5%、1.7%、1.9%，表明仪器精密度良好。

2.2.4 重复性

绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷峰面积的RSD分别为1.9%、1.2%、1.8%、2.0%，表明方法重复性良好。

2.2.5 稳定性

绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷峰面积的RSD分别为1.7%、1.5%、2.1%、2.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性较好。

2.2.6 加样回收率

绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷的平均回收率分别为97.5%（RSD为1.8%）、99.7%（RSD为2.1%）、97.8%（RSD为2.1%）、98.4%（RSD为2.3%），表明该方法的加样回收效果较好。

2.2.7 不同生长季节桑叶中绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷含量

表 3 不同生长季节桑叶中芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、绿原酸和DNJ含量（n=3）Table 3 The contents of chlorogenic acid, rutin, isoquercitrin, astragalin and DNJ in mulberry leaves in different growth seasons (n=3) mg/g

按1.3.5节方法测定不同生长季节桑叶中次生代谢产物绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷4 种成分含量，结果见表3。由表3可知，桑叶黄酮类成分在不同生长季节含量呈动态变化，绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷4 个单体成分变化规律基本一致。四者含量在4、5月份较高，在8、9月份当气温较高时含量却显著下降，之后含量随气温下降又逐渐升高，11月份经霜后含量达最高，芦丁达0.72 mg/g，异槲皮苷达1.16 mg/g、紫云英苷达0.77 mg/g、绿原酸达1.39 mg/g，12月份之后自然脱落的枯桑叶含量最低，芦丁为0.25 mg/g、异槲皮苷为0.32 mg/g、紫云英苷为0.31 mg/g、绿原酸为0.24 mg/g。

2.3 柱前衍生化-HPLC-荧光检测法测定生物碱类成分（DNJ）含量结果

2.3.1 生物碱类成分（DNJ）HPLC测定

图 3 DNJ对照品（A）和桑叶样品（B）HPLC图Fig.3 HPLC chromatograms of DNJ reference substances (A) and real sample (B)

按1.3.3.3节色谱条件对桑叶中DNJ进行分析，记录色谱图。从图3可以看出，样品中的DNJ与相邻组分均得到良好的基线分离，试剂的水解副产物FMOC-OH和Gly-FMOC均不干扰组分的测定。

2.3.2 标准曲线和线性范围考察

分别取10 μL对照品溶液，按1.3.2.2节衍生化步骤衍生和1.3.3.3节液相色谱分析。以峰面积为纵坐标，对照品溶液质量浓度（μg/mL）为横坐标进行线性回归，得DNJ的回归方程为：Y=37 026.8X-42 091.4（r=0.999 9），结果表明DNJ在9.5～152 μg/mL范围内线性关系良好。

2.3.3 方法学考察

精密度实验DNJ峰面积的RSD为1.8%，重复性实验DNJ峰面积的RSD为2.0%，稳定性实验DNJ峰面积的RSD为1.8%，DNJ的平均回收率为98.3%（RSD为1.5%），RSD均小于2.0%。表明方法可靠。

2.3.4 不同生长季节桑叶DNJ含量

按1.3.5节方法测定不同生长季节桑叶样品中生物碱类成分（DNJ）含量，结果见表3。由表3可知，不同生长季节的桑叶中生物碱类成分（DNJ）含量动态变化与黄酮类成分相反，见图4。4月份气温较低时，DNJ含量较低，为0.69 mg/g，5月份随着气温逐渐升高，含量逐渐升高，7、8月份含量最高，达到2.88 mg/g，从9、10月份随着温度降低含量持续下降，11月份经霜后含量更低，12月份桑叶自然脱落，含量仅为0.35 mg/g。

图 4 不同生长季节桑叶中芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、绿原酸和DNJ含量动态变化图Fig.4 Dynamic changes in the contents of chlorogenic acid, rutin, isoquercitrin, astragalin and DNJ in mulberry leaves in different growth seasons

2.4 气温与黄酮类成分、生物碱类成分含量间的相关性分析

图 5 不同日期平均气温变化图Fig.5 The average temperatures at different dates

表 4 平均气温与芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、绿原酸、DNJ含量间的相关性Table 4 Correlation between average temperature and the contents of chlorogenic acid, rutin, isoquercitrin, astragalin and DNJ

不同日期平均气温的变化趋势见图5，结合图4。按1.3.6节方法采用SPSS 20.0进行平均气温与桑叶中芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、绿原酸、DNJ含量的相关性分析，结果见表4。由表4可知，平均气温与黄酮类成分含量呈负相关，与芦丁相关系数为-0.389（P＜0.05），与异槲皮苷相关系数为-0.180，与紫云英苷相关系数为-0.394（P＜0.05），与绿原酸相关系数为-0.507（P＜0.01），与4 个单体成分总和的相关系数为-0.467。平均气温与DNJ含量呈极显著正相关，相关系数为0.882（P＜0.01）。

3 讨 论

本研究先采用HPLC-MS对桑叶进行定性分析，然后选择其中4 种主要的已知成分（绿原酸、芦丁、异槲皮苷和紫云英苷），进行HPLC定量分析，绿原酸属于苯丙素类物质，芦丁、异槲皮苷和紫云英苷属于黄酮类物质，但其均属于多酚类成分[20]，且结构中均含苯环和酚羟基，故能在同一流动相条件下检出，因此本实验选择绿原酸与芦丁、异槲皮苷、紫云英苷4 个成分同时定量分析，研究其动态变化规律。

桑叶经霜前后主要是环境温度发生变化。平均气侯温度与次生代谢产物含量间的相关性分析显示，气温与黄酮类4个成分总和含量呈极显著负相关，与DNJ含量呈极显著正相关。不同生长期桑叶中次生代谢产物黄酮类成分在4、5月份气温低时含量较高，7、8、9月份气温高时含量变低，10、11月份霜降节气前后（霜降10月23日）随着气温下降含量又明显升高。DNJ在4、5月份气温低时含量较低，7、8月份气温较高时，DNJ含量较高，9月份随着气温下降，DNJ含量下降，经霜后含量更低。这些变化说明气候温度作为环境胁迫因子，其变化影响了桑叶中次生代谢产物的表达。气温高时黄酮类成分含量降低，气温低时黄酮类成分含量反而升高，说明较低的气温有利于黄酮类成分的合成与积累；而DNJ含量气温高时较高，气温低时含量变低，说明较高的气温有利于生物碱类成分的合成与积累。

桑叶为疏散风热、清肺润燥、清肝明目的常用中药，药用以采收于初霜后为佳。而桑叶经霜后本研究发现桑叶中生物碱类成分含量变低，黄酮类成分含量变高，因生物碱类成分（DNJ）是降血糖主要活性成分，具有糖苷酶抑制剂的作用，也是桑叶的抗逆性成分，其对疏散风热、清热润肺、清肝明目的功效可能影响较小；桑叶中黄酮类成分具有抗菌、抗炎等生物活性[6]，与疏散风热、清肺润燥功效相关。因此，桑叶经霜药用可能与黄酮类成分有关，其具体机制本课题组正进一步研究。

本研究结果为进一步研究桑叶经霜采收活性成分变化与功效之间的相关性提供了一定理论支持，为阐明桑叶经霜采收的科学内涵提供了实验依据；同时提示在桑叶资源开发及不同临床应用上，应重视其不同季节所含的成分变化，根据桑叶不同成分的功效，合理安排采收时间。

[1] 国家药典委员会. 中国药典: 一部[S]. 北京: 中国医药科技出版社, 2010: 279.

[2] NGUYEN T D, PHUNG T X B, LE T P Q, et al. Cytotoxic prenylated fl avonoids from Morus alba[J]. Fitoterapia, 2010, 81(8): 1224-1227.

[3] DOI K, KOJIMA T, MAKINO M, et al. Studies on the constituents of the leaves of Morus alba L.[J]. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2001, 49(2):151-153.

[4] 邱进, 王晓静, 王元书, 等. 桑叶化学成分的研究[J]. 中成药, 2008, 30(9): 1-2.

[5] 杨燕, 王洪庆, 陈若芸. 桑叶中的黄酮类化合物[J]. 药学学报, 2010, 45(1): 77-81.

[6] 欧阳臻, 陈钧. 桑叶的化学成分及其药理作用研究进展[J]. 江苏大学学报: 自然科学版, 2003, 24(6): 39-44.

[7] STITT M, FEMIE A R. From measurements of metabolites to metabolomics: an ‘on the fl y’ perspective illustrated by recent studies of carbon-nitrogen interactions[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2003, 14(2): 136-144.

[8] ALLWOOD J W, de VOS R C, MUING A, et al. Plant metabolomics and its potential for systems biology research: background concepts, technology, and methodology[J]. Methods in Enzymology, 2011, 500(1): 299-336.

[9] ZHANG Aihua, SUN Hui, WANG Zhigang, et al. Metabolomics: towards understanding traditional Chinese medicine[J]. Planta Medica, 2010, 76(17): 2026- 2035.

[10] QIU J. Traditional medicine: a culture in the balance[J]. Nature, 2007, 448: 126-128.

[11] 李凡, 裘雅渔, 钱文春, 等. 桑叶中生物碱和1-脱氧野尻霉素(DNJ)含量的考察[J]. 中国药学杂志, 2008, 43(3): 177-179.

[12] 吴好好, 蒋惠娣, 高处寒, 等. 桑叶中绿原酸和主要黄酮苷的RPHPLC测定[J]. 药物分析杂志, 2007, 27(3): 374-377.

[13] 欧阳臻, 李永辉, 徐卫东, 等. 高效液相色谱-荧光检测法测定桑叶中1-脱氧野尻霉素(DNJ)含量[J]. 中国中药杂志, 2005, 30(9): 682-685.

[14] 杨兵, 欧阳臻, 赵明, 等. 不同生长季节桑叶中1-脱氧野尻霉素、芦丁及多糖含量动态研究[J]. 中药材, 2012, 35(6): 876-879.

[15] 欧阳臻, 李永辉, 陈钧. 不同季节桑叶中DNJ的含量测定[J]. 食品科学, 2004, 25(10): 211-213.

[16] 欧阳臻, 陈钧, 李永辉. 柱前衍生化高效液相色谱荧光检测法测定桑叶中的1-脱氧野尻霉素[J]. 分析化学, 2005, 33(6): 817-820.

[17] INES T, WALID E, HEDIA H, et al. Identifi cation and quantifi cation of phenolic acids and fl avonol glycosides in Tunisian Morus species by HPLC-DAD and HPLC-MS[J]. Journal of Functional Foods, 2012, 4(1): 367-374.

[18] DUGO P, DONATO P, CACCIOLA F, et al. Characterization of the polyphenolic fraction of Morus alba leaves extracts by HPLC coupled to a hybrid IT-TOF MS system[J]. Journal of Separation Science, 2009, 32(21): 3627-3634.

[19] 刘利, 殷志琦, 潘一乐, 等. 桑叶次生代谢产物分析[J]. 蚕业科学, 2005, 31(4): 413-417.

[20] 张鞍灵, 马琼, 高锦明, 等. 绿原酸及其类似物与生物活性[J]. 中草药, 2001, 32(2): 173-176.

Differential Expression of Secondary Metabolites in Mulberry Leaves before and after Frost

ZHANG Weiwanqi, OUYANG Zhen*, ZHAO Ming, WEI Yuan, SHAO Yang, WANG Zhiwan, WANG Qiang
(School of Pharmacy, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

In order to validate whether or not frosted mulberry leaves have better quality, the flavonoids of mulberry leaves were identified by high performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS), the contents of four main components, namely chlorogenic acid, rutin, isoquercitrin, and astragalin were simultaneously determined by HPLC and the content of 1-deoxynojirimycin (DNJ) was assayed by pre-column derivatization HPLC with fluorescence detection. We investigated dynamic changes in the flavonoid composition and the contents of four individual flavonoids and DNJ in mulberry leaves across seasons. The results showed that the contents of flavonoids in mulberry leaves were lower in July and August when temperature was high and reached their maximum in November or October after frost. The DNJ content of mulberry leaves in July and August reached its maximum and then decreased in September or October with declining temperature to its minimum after frost. It is concluded that alkaloids may contribute little to the functions of mulberry leaves in evacuating wind-heat, clearing away lung-heat and moistening dryness. The medicinal components of frosted mulberry leaves may be associated with flavonoids. This study can provide a theoretical basis for elucidating scientific connotation of frosted mulberry leaves.

mulberry leaves； secondary metabolites； high performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS)； frost； dynamic change

R284.1

A

1002-6630（2015）08-0109-06

10.7506/spkx1002-6630-201508019

2014-08-08

国家自然科学基金面上项目（81072985/H2801）；国家自然科学基金青年科学基金项目（81102522/H3112）；

江苏省“六大人才高峰”第七批高层次人才项目；江苏省产学研前瞻性联合研究项目（BY2012171）；

江苏省苏北科技发展专项资金项目（BC2011461）；江苏省大学生实践创新训练计划立项（201310299031Z）；

江苏大学第12批大学生科研立项（12A500）

张魏琬麒（1992—），女，硕士研究生，研究方向为中药活性成分。E-mail：zwwq410@163.com

*通信作者：欧阳臻（1964—），教授，博士，研究方向为中药活性成分及新药开发。E-mail：zhenouyang@ujs.edu.cn