化学显色法检测磺胺类药物的残留量

周秀锦， 张 静， 邵宏宏， 周向阳， 郑 斌， 周宇芳

(1.舟山出入境检验检疫局，浙江舟山 316000；2.浙江省海洋开发研究院，浙江舟山 316000)

化学显色法检测磺胺类药物的残留量

周秀锦1， 张 静1， 邵宏宏1， 周向阳1， 郑 斌2， 周宇芳2

(1.舟山出入境检验检疫局，浙江舟山 316000；2.浙江省海洋开发研究院，浙江舟山 316000)

摘要[目的] 建立水产品中磺胺类药物残留的化学显色快速检测法。[方法] 用甲醇提取水产品中的磺胺类药物残留，采用化学显色法对其进行快速检测。[结果] 通过磺胺类药物残留与特定的衍生化试剂反应，形成稳定的紫红色衍生物，检测灵敏度最低可达50 μg/kg。[结论] 该方法检测限能满足欧盟及我国对磺胺类药物检测的需求，且能够实现水产样品中多种磺胺类药物的现场快速检测。

关键词磺胺类药物；化学显色；现场检测；快速检测

磺胺类药物是以对氨基苯磺酰胺结构为主体的合成抗菌素的总称，是一类用于预防和治疗细菌感染性疾病的化学治疗药物[1-3]。近年来，随着国内外对磺胺类药物残留的分析进行了大量研究，发现了许多种检测磺胺类药物的方法，包括高效液相色谱法[4-7]、液相色谱-质谱法[8-9]、胶体金免疫层析法[10]、免疫分析法[11]和近红外光谱法[12]等，但这些方法只注重于实验室传统检测，且存在样品前处理步骤复杂、耗费时间长、低通量、成本高等缺点。然而，水产品中药物残留的快速检测技术十分匮乏，且前实验室传统的检测方式很难实现快速、高效的检测效果，越来越不适应食品的生产、流通和销售特点。笔者围绕水产品中有重大危害残留的药物磺胺类药物，采用柱前衍生的方法，以化学显色方法为主，水产品中的磺胺类药物残留使用合适的试剂进行快速提取和快速衍生化反应，选择适合目标物的SPE柱净化浓缩样液，洗脱后采用合适方法进行快速准确地检测和判断。

1材料与方法

1.1试剂盐酸、冰醋酸、硫酸、氢氧化钠、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、亚硝酸钠、β-萘酚，均为分析纯；乙腈和甲醇，色谱纯；衍生化试剂01和衍生化试剂02；磺胺类药物标准品：磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺甲基异恶唑；试验用水为蒸馏水和去离子水；样品为新鲜对虾，购于舟山水产品批发市场。

1.2设备和器材液相色谱串联质谱仪(API4000Q-TRAP)； 色谱柱为SHISEIDO CAPCELL PAK C18 MG S5(150 mm×2.0 mm)；恒温水浴；离心机；硅胶柱；HLB柱；氧化铝柱；ENVI-18；层析柱(自填，3 ml)等。

1.3检测条件

1.3.1色谱条件。色谱柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 MG S5(150 mm×2.0 mm)流动相：A为0.1%的冰乙酸，B为甲醇；进样量为10 μl。

1.3.2质谱条件。电喷雾离子源；正离子扫描；多反应监测(MRM)；气帘气压力(CUR)：10 psi；雾化气压力(GS1)：60 psi；辅助气压力(GS2)：60 psi；电喷雾电压(IS)：5 500 v；离子源温度(TEM)：500 ℃；碰撞气压力(CAD)：6.00 psi；EP电压：7.00 v；碰撞室出口电压(CXP)：15.0 V；去簇电压(DP)和碰撞气能量(CE)见表1。

表1　磺胺类药物的部分参数

注：*表示定量离子。

1.4检测方法

1.4.1磺胺类药物标准物质的检测。用甲醇将磺胺类药物标准品溶解并稀释到50和100 μg/L的浓度。分别取1 ml浓度为50和100 μg/L 磺胺类药物标准溶液，加入4 ml的甲醇和2 ml衍生化试剂01，振摇5 min后加入0.1 ml衍生化试剂02，振荡1 min，静置5 min，观察上层液体颜色；每5个重复，同时作试剂空白试验。

1.4.2贝类样品的前处理。准确称取粉碎组织样品5.0 g置于50 ml离心管中，取匀质的虾肉5.0 g，加入5.0 g的无水硫酸钠和甲醇20 ml，振荡2 min后，静置分层或4 000 r/min离心5 min，取约5 ml上清液于倒空的离心管瓶中，作为样品处理液；在5 ml样品处理液中加入2 ml衍生化试剂01，振荡5 min后加入0.1 ml衍生化试剂02，振荡1 min后静置5 min，观察上层液体颜色；若上层液体显红色则表明样品中含有磺胺类药物，并与标准品进行比较确定磺胺类药物的含量，初步的检测下限为100 μg/kg。

取层析柱一支依次加入2 ml甲醇和5 ml蒸馏水于层析柱中，控制流速为1～2滴/s，弃去流出液；衍生后的上层液体加入活化后的层析柱中，再加入2 ml去离子水淋洗柱子，抽干；最后，加入0.8 ml乙酸乙酯洗脱于5 ml离心管，观察洗脱液颜色。

结果判断：洗脱液边自然挥发边观察颜色：若显红色，则表明样品中含有磺胺类物质，其含量在50 μg/kg以上。

2结果与分析

2.1样品前处理的最优条件

2.1.1pH对衍生化效果的影响。取100 μg/kg磺胺类药物标准溶液1 ml，加入4 ml的甲醇，再加入衍生化试剂01(调节pH分别为6、8、10、12)，进行衍生化反应，直接观察不同pH下的衍生化效果，确定最佳的衍生化pH。结果表明，pH为6时无颜色变化；当pH≥8时，颜色有变化，且碱性越大，颜色越红，因此当pH为12时衍生效果最为理想。

2.1.2层析柱的优选。将样品前处理中的衍生化上层液体，分别经自填层析柱、硅胶柱、HLB柱、氧化铝柱、ENVI-18浓缩和净化，根据每个SPE柱提供的处理方法，依次活化、平衡、上样、淋洗和洗脱，观察洗脱液的颜色变化。结果表明，层析柱、硅胶柱、HLB柱、氧化铝柱、ENVI-18都有保留，但是自填层析柱的保留效率最好(图1～2)。

2.2虾肉样品中磺胺类药物残留的检测磺胺类药物标准物质衍生物呈明显的紫红色，且颜色随着含量的增加不断加深，空白对照则不显变色。当磺胺类药物标准物质浓度在50 μg/L以上时，其衍生物在离心管内呈紫红色。将该衍生物进行层析柱浓缩和净化，在层析柱中的颜色更加明显，洗脱后的颜色放置200 min后无明显变化。

被检虾肉样品中，加标样品(添加磺胺嘧啶浓度为85 μg/kg)经过前处理，取1 ml的提取液直接上液相色谱串联质谱仪，其质谱图如图3所示。另取5 ml提取液进行衍生化反应，其衍生化产物呈现紫红色，阴性样品无显色(图4)。

2.3稳定特异性试验结果磺胺类药物添加量分别为50和100 μg/kg，平行测定12次。进行样品前处理，提取液进衍生化反应，在衍生化后1.0、5.0、10、25、50、100、200 min分别观察显色现象。结果表明，衍生化产物在200 min内相对稳定，紫红显色现象明显。提取液的液相色谱串联质谱图如图5所示，提取液的衍生化显色图如图6所示。

2.4精密度试验结果对60份已知含量的空白样品进行磺胺类药物标准添加验证试验，标准物质添加含量分别为50和100 μg/kg，由不同操作人员进行验证试验。当磺胺类药物残留添加浓度分别为50和100 μg/kg时，均可观察到明显的紫红显色，而阴性样品无出现颜色变化。

2.5比对验证试验结果依据GB/T 21316-2007方法采样液相色谱串联质谱仪和中化学显色法快速检测325份水产品盲样中的磺胺类药物残留，将二结果进行比对。液相色谱串联质谱法检测出含有磺胺类药物残留的样品有62个，总含量范围为2.0～103.5 μg/kg，总含量高于40 μg/kg的样品有16个，其中40.0～50.0 μg/kg之间的样品有2个。化学显色法快速检测325份样品，磺胺类药物残留含量在40.0～103.5 μg/kg的16个样品均有不同程度的显色反应，除40.0～50.0 μg/kg的2个样品显色较弱，需要细心辨认之外，二者结果符合。

3小结

贝类样品采用甲醇提取，层析柱净化富集，在碱性条件下进行衍生化反应，衍生化产物在200 min内保持相对稳定，检测在30 min内完成，实现了磺胺类药物残留的快速筛查，方法快速、准确、实用，可以有效筛选虾肉中磺胺类药物残留。

参考文献

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中图分类号S851.34+7文献标识码A文章编号0517-6611(2015)30-109-03

基金项目国家科技支撑项目(2012BAD29B06)；舟山市科技项目(2012C23005)。

作者简介周秀锦(1974- )，女，河南商水人，高级工程师，硕士，从事食品安全及标准化研究。

收稿日期2015-09-08

Determination of Sulfonamide Residues in Aquatic Products by Using Chemical Staining Method

ZHOU Xiu-jin, ZHANG jing, SHAO Hong-hong et al(Zhoushan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhoushan, Zhejiang 316000)

Abstract[Objective] The aim of this study was to develop a rapid chemical staining method of detecting the residues of sulfonamide in aquatic products. [Method] Sulfonamide residues in aquatic products were extracted with methanol and rapidly determined by using chemical staining method. [Result] Stable mauve derivatives were formed in the reaction of specific derivatization reagent and sulfonamide residues. The lowest detection sensitivity could reach 50 μg/kg. [Conclusion] The detection limit of this method could meet the detection requirements of sulfonamide residues in EU and China, and realize the on-site rapid detection of many kinds of sulfonamide residues in aquatic products samples.

Key wordsSulfonamides; Chemical staining method; On-site detection; Rapid detection