水解法测定肥料中聚谷氨酸含量的探讨

刘红阳　程显好　王萌　李维焕

摘 要：为确定水解法定量测定肥料中聚谷氨酸（γ-PGA）含量的条件，优化了水解时间，检测了水解过程对谷氨酸的破坏情况，确定了水解法定量测定肥料中聚谷氨酸含量的参数条件。以水解法验证了醇沉过程对聚谷氨酸的沉淀的程度。水解法测定聚谷氨酸含量简单易行，结果可靠。

关键词：聚谷氨酸；测定方法；定量分析；水解条件

中图分类号：TQ922.1 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20151132006

γ-聚谷氨酸（poly-γ-glutamic acid，γ-PGA，或称“聚麸胺酸”）是一种由芽孢杆菌属微生物发酵产生的、具有水溶性的、可生物降解的高分子多聚合物[1]。聚谷氨酸具有较多侧链，可以与多种基团形成具有特殊性质的复合物。由于其安全、无害、有良好的保湿性能，聚谷氨酸及其复合物常被用于医药[2]、食品、化妆品等[3]领域。在农业上使用聚谷氨酸，有提高肥料的利用率，增加土壤保水性，络合重金属元素，缓冲盐碱和pH，隔绝有害物质，提高植物的抗病能力等作用。除此之外，其自然水解产生的谷氨酸也是多种动植物体内重要化学反应的参与物质。

本实验探究了使用水解的方法进行聚谷氨酸含量的测定的相关条件。

1 材料和方法

1.1 实验材料

谷氨酸/葡萄糖/乳酸三合一标准液（100mg/dL）；L-谷氨酸、无水乙醇、甘油、盐酸、NaOH等都为分析纯试剂；台湾味丹公司提供的聚谷氨酸样品（液体）；台湾味丹公司提供的聚谷氨酸高浓度样品（固体）。

1.2 实验仪器

SBA-40E生物传感分析仪；pH 计；油浴锅；离心机；电热鼓风干燥箱；电子天平。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

液体样品先经8000rpm离心20min，去除菌体等杂质，取1ml上清液，进行适当稀释后，使用生物传感分析仪测定游离谷氨酸的含量[4]。再取5ml上清液加入水解酸，110℃水解一定时间，水解液冷却、中和至pH 5～8，定容至一定体积，使用生物传感分析仪测定谷氨酸含量。

1.3.2水解时间的确定

取聚谷氨酸样品进行水解，每隔一定时间取样，测定水解液中游离谷氨酸含量。

1.3.3水解过程对样品中谷氨酸破坏的测定

用分析纯的谷氨酸配制0.1g/ml的谷氨酸水溶液，分别取5ml加入7组蒸馏瓶中，进行水解操作，在不同时间终止水解，测定水解液中游离谷氨酸的含量，比较谷氨酸量是否有降低。

1.3.4醇沉步骤对水解结果的影响

取离心后的聚谷氨酸样品液30ml调至一定pH后，加入到3～5倍无水乙醇中，进行醇沉沉淀并离心、烘干。将上一步所得沉淀用一定量的水溶解，再次进行醇沉操作，如此往复，测定每一次烘干后的沉淀质量。再将第一次醇沉过后的沉淀物加一定量水溶解至原始体积，进行水解，另取同样体积离心后的原液进行直接水解，两者进行比较。

2 结果与讨论

2.1 水解时间对水解结果的影响

对于味丹公司的聚谷氨酸液体肥料，利用18.5%盐酸在110℃温度下进行水解实验，每隔2h取样测定水解结果，水解液中谷氨酸含量见表1。当水解时间达到4h以后，谷氨酸含量不再升高。所以4h的水解时间能够保证聚谷氨酸的水解完全。

2.2 水解过程对样品中谷氨酸含量破坏的影响

氨基酸水解的常规方法是采用5.7mol/L的盐酸在真空状况下与110℃水解24h，也有在150℃快速水解90分钟[5]。真空条件是为了隔绝氧气，防止有些敏感氨基酸在高温条件下氧化破坏。非真空条件下高温水解，是否会对谷氨酸氧化破坏，以谷氨酸代替聚谷氨酸，模拟水解条件，测定水解过程中谷氨酸含量变化情况，探讨谷氨酸是否发生变化。结果表明，谷氨酸有较好的稳定性，在非真空条件下水解，其含量没有发生改变。这说明水解过程中，不必采取真空条件。

2.3醇沉步骤对水解结果的影响

将液体的聚谷氨酸肥料成品进行醇沉实验，发现醇沉法不能完全沉淀液体中的聚谷氨酸，而且沉淀结果受pH值影响较大，每次沉淀都有20%左右的聚谷氨酸损失，经过连续四次沉淀，聚谷氨酸几乎损失殆尽，结果见图1。因此使用醇沉法作为PGA测定方法，受很多因素影响，准确度不够。

图1醇沉次数与沉淀量关系

将第一次醇沉过后的沉淀物加一定量水溶解至原始体积，进行水解，另取同样体积离心后的原液进行直接水解，两者进行比较，结果见表3。

两种方法测定结果差别在8%，但实际上醇沉法测定的聚谷氨酸中一方面携带了大分子蛋白质、多糖等杂质，另一方面聚谷氨酸也能络合许多金属离子，所以沉淀称重实际上远远高于其中所含的纯聚谷氨酸的量。

2.4水解法与高效液相色谱法结论对比

将不同批次的产品进行高效液相色谱法测定与水解法测定进行比较，结果如图2所示。

图2 水解法与高效液相色谱法结果对比

高效液相色谱法所得结论与水解法结论相吻合，说明水解法具有较好的准确性和稳定性。

3 结论

在定量测定聚谷氨酸的含量时，水解法具有简便、快捷、准确的优势。水解过程对谷氨酸含量没有破坏，也不需要抽真空封管水解。醇沉步骤会对水解后得出的含量数值产生影响，因此直接水解得到的结果比醇沉水解得到的结果更加准确。

参考文献

[1]石冬霞. γ-聚谷氨酸的微生物合成、分离纯化及性质与应用研究[D]. 哈尔滨商业大学， 2010.

[2]Buescher J M， Margaritis A. Microbial biosynthesis of polyglutamic acid biopolymer and applications in the biopharmaceutical， biomedical and food industries[J]. Crit Rev Biotechnol， 2007， 27（1）： 1-19.

[3]Bhat A R， Irorere V U， Bartlett T， et al. Improving survival of probiotic bacteria using bacterial poly-gamma-glutamic acid[J]. Int J Food Microbiol， 2015， 196： 24-31.

[4]张轶， 卢珂， 孟杰， et al. 谷氨酸分析仪测定发酵液中γ-聚谷氨酸的实验条件研究[J]. 食品研究与开发， 2007（12）： 132-135.

[5]张庆庆， 金鑫强， 陈剑翔， et al. 发酵液中γ-聚谷氨酸含量快速测定方法研究[J]. 食品工业科技， 2012（19）： 294-296，300.