乳清蛋白酶解条件优化

孙 洋 钱 方 赵 磊 刘晓慧 牟光庆

（1.大连工业大学信息科学与工程学院，辽宁 大连 116034；2.大连工业大学食品学院，辽宁 大连 116034）

近年来随着人们营养健康意识的增强，蛋白质和脂肪含量相当于原料乳10倍的干酪，成为世界上唯一保持连续上升的乳制品［1］。按生产1t干酪排放9t乳清计，每年有上亿吨的乳清等待利用和处理［2］。乳清不仅产量大，且营养丰富（含乳清蛋白、脂肪、乳糖、矿物质和水溶性维生素等），必需氨基酸组成完全符合或超出FAO/WHO要求［3］。由于蛋白酶能部分降解乳清蛋白多肽骨架，增加特殊功能基团，具有改变乳清蛋白的乳化性、稳定性等功能特性［4］。也是降低其过敏反应的有效方法之一［5］。本研究为便于乳清蛋白酶解后直接用于乳制品中，因此在自然pH下对乳清蛋白预处理及酶解条件进行优化，以提高乳清蛋白酶解产物的利用率和营养价值。

1 材料与方法

1.1 材料

乳清浓缩蛋白（WPC80）：美国哥兰比亚乳业公司；

中性蛋白酶：酶活14.6万U/g，广西南宁庞博生物工程有限公司；

木瓜蛋白酶：酶活21.4万U/g，广西南宁庞博生物工程有限公司；

胰蛋白酶：酶活10.0万U/g，北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

电热恒温水浴锅：DK-S22型，上海精密实验设备有限公司；

光栅分光光度计：722型，山东高密彩虹分析仪器有限公司；

精密pH计：pH S-3B型，上海雷磁仪器厂；

多管架自动平衡离心机：TDZ5-WS型，湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 测定项目及方法

（1）蛋白酶活力测定：福林—酚法［6，7］。

（2）蛋白含量测定：微量凯氏定氮法［8］。

（3）蛋白水解度（DH）测定：改进pH-stat法［9，10］。

1.3.2 预处理方式对乳清蛋白酶解的影响 分别采用63℃/30min，80℃/10min，95℃/5min的预处理方式对乳清蛋白WPC80进行处理，以未经预处理的作对照。水解条件：WPC80 8%，初始pH 6.8，木瓜蛋白酶量5 000U/g·蛋白，温度50℃，时间60min。通过乳清蛋白水解程度来确定最佳的预处理方式。

1.3.3 不同蛋白酶水解乳清蛋白的效果比较 选用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶，在加酶量5 000U/g·蛋白，初始pH 6.8，50℃，60min的条件下对终浓度8%的乳清蛋白（WPC80）进行酶解，并经沸水10min，冷至室温后，通过比较水解程度来确定乳清蛋白酶解的最佳酶。

1.3.4 单因素试验

（1）加酶量对酶解乳清蛋白的影响：在初始pH 6.8、水解温度50℃、水解60min条件下，用最佳酶对终浓度8%的乳清蛋白进行酶解，分别测定在1 000，3 000，5 000，7 000，9 000U/g·蛋白加酶量的水解度。

（2）水解温度对酶解乳清蛋白的影响：在初始pH 6.8、加酶量5 000U/g·蛋白、水解60min条件下，用最佳酶对终浓度8%的乳清蛋白进行酶解，分别测定在40，45，50，55，60℃水解温度下的水解度。

（3）水解时间对酶解乳清蛋白的影响：在初始pH 6.8、水解温度50℃、加酶量5 000U/g·蛋白条件下，用最佳酶对终浓度8%的乳清蛋白进行酶解，分别测定30，60，90，120，150min水解时间的水解度。

1.3.5 正交旋转回归试验设计 基于单因素试验结果，以木瓜蛋白酶的水解温度、水解时间和加酶量3个因素为自变量，以乳清蛋白水解度为响应值，设计20个试验点的正交旋转回归试验，保证试验点最小的前提下，提高乳清蛋白酶解效率，并用Design Expert 8.0.6统计软件对结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 预处理方式对酶解乳清蛋白的影响

由于乳清蛋白的热稳定性较差，不同的预处理方式对其酶解效果影响较大。为了得到最佳水解效果，按表1的预处理方式及水解条件酶解乳清蛋白WPC，并测其水解度。

由图1可知，其中80℃处理10min的水解度最大，达9.21%。所以选用80℃处理10min对酶解前乳清蛋白进行预处理。

图1 不同预处理方式水解乳清蛋白的比较Figure 1 Comparison of different pretreatments of enzymolysis of whey protein

2.2 不同蛋白酶水解乳清蛋白的效果比较

考虑到酶解反应受温度、加酶量、底物浓度和水解时间等多种因素影响。为寻找水解乳清蛋白的适宜酶及其最佳酶解条件，本研究分别用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶3种酶，在相同酶解条件水解乳清蛋白，比较其水解程度。由图2可知，木瓜蛋白酶水解度最大，达8.96%。因此选用木瓜蛋白酶作为乳清蛋白水解最佳用酶。

图2 不同蛋白酶水解乳清蛋白的比较Figure 2 Comparison of different proteases of enzymolysis of whey protein

2.3 单因素试验

2.3.1 加酶量对酶解乳清蛋白的影响 由图3可知，在同一初始pH、水解温度和时间下，当木瓜蛋白酶量低于5 000U/g·蛋白时，乳清蛋白水解度随酶量的增加而明显升高；而加酶量高于5 000U/g·蛋白时，由于底物浓度和酶逐渐达到饱和，水解度升高幅度不明显。因此，初步确定木瓜蛋白酶水解乳清蛋白适宜用酶量为5 000U/g·蛋白，相应水解度DH为9.65%。

图3 加酶量对蛋白酶水解乳清蛋白的影响Figure 3 Effects of different enzyme dosage on whey protein enzymolysis

2.3.2 水解温度对酶解乳清蛋白的影响 由图4可知，在同一初始pH、水解时间和加酶量下，酶解温度控制在40～55℃时，乳清蛋白水解度随温度上升而增大，而高于55℃时，则随着温度升高，水解度降低，说明酶活力下降。木瓜蛋白酶水解乳清蛋白的适宜水解温度为55℃，相应水解度DH为9.96%。

2.3.3 水解时间对酶解乳清蛋白的影响 由图5可知，在同一水解温度、初始pH值和加酶量下，乳清蛋白水解度随水解时间的延长而升高。而水解90min后，水解度趋势线变缓。因此，初步确定木瓜蛋白酶水解乳清蛋白适宜水解时间为90min，相应水解度DH为9.87%。

图4 水解温度对酶解乳清蛋白的影响Figure 4 Effects of different temperature on whey protein enzymolysis

图5 水解时间对酶解乳清蛋白的影响Figure 5 Effects of different time on whey protein enzymolysis

2.4 正交旋转回归试验

2.4.1 正交旋转回归设计酶解乳清蛋白试验结果分析 根据单因素试验结果确定的回归正交旋转试验因素水平取值见表1，木瓜蛋白酶解乳清蛋白回归正交旋转试验结果见表2，方差分析见表3、4。

用Design-Expert软件进行回归分析，对各因素回归拟合后得回归方程：

表1 正交旋转回归设计的因素水平编码表Table 1 Factors level coding schedule of regression orthogonal rotary tests

表2 正交旋转回归设计酶解乳清蛋白试验与结果Table 2 Design and results of orthogonal rotational regression of whey protein enzymolysis

由表3可知，模型交互项X1X2、X1X3、X2X3及二次项X22差异不显著，模型一次项X2、X3及二次项X12、X32差异极显著，模型一次项X1差异显著，说明响应面分析所选的3个主效应显著。其中各种因素间的交互作用较小。同时由F值（各项均方/剩余误差均方）可看出，水解温度、水解时间、加酶量3个因素中加酶量对乳清蛋白水解度影响最大，其次为水解时间和温度。

表3 正交试验结果方差分析表Table 3 Variance analysis table of the result of orthogonal tests

表3 正交试验结果方差分析表Table 3 Variance analysis table of the result of orthogonal tests

＊为显著（P＜0.05），＊＊为高度显著（P＜0.01）；F0.01（1，10）＝10.04，F0.05（1，10）＝4.96；F0.01（5，5）＝11.0，F0.05（5，5）＝5.05；F0.01（9，10）＝4.95，F0.05（9，10）＝3.02。

变异来源 系数估计值平方和SS 自由度 均方MS F 值 显著性截距 10.40 ——X1 0.22 0.66 1 0.66 7.10 ＊X2 0.30 1.26 1 1.26 13.55 ＊＊X3 1.31 23.30 1 23.30 250.54 ＊＊X1X2 0.02 0.00 1 0.00 0.03 X1X3 0.01 0.00 1 0.00 0.01 X2X3 －0.04 0.01 1 0.01 0.13 ＊＊X12 －0.39 2.20 1 2.20 23.66 X22 －0.16 0.35 1 0.35 3.76 ＊＊X32 －0.40 2.28 1 2.28 24.52 ＊＊回归模型30.35 19 29.42 9 3.27 35.16剩余误差 0.93 10 0.09纯误差 0.18 5 0.04失拟项 0.75 5 0.15 4.17总变异

表4 乳清蛋白水解度模型的方差分析Table 4 Variance analysis of the model of DH

本试验模型不同处理间差异极显著，说明回归方程描述各因子与响应值之间的关系时，其应变量与全体自变量之间的线性关系是显著的。同时变异系数（CV＝12.96%）也说明了这种试验方法是可靠的。复相关系数平方R2＝回归平方和/总平方和＝96.94%，说明由这3个因素及二次项能解释96.94%响应值的变化。由表3可知，回归方程的显著性检验F值＝35.16＞F0.01（9，10）＝4.95极显著，说明试验数据与采用的数学模型相符合；回归方程的失拟性检验F值＝4.17＜F0.05（5，5）＝5.05不显著，可认为所选用的二次模型是适当的［11－15］。

2.4.2 响应面效应分析 用Design Expert软件进行分析，作出响应面和等高线，得到因素间的交互关系及对乳清蛋白水解度的影响。由图6可知，水解体系加酶量一定时，乳清蛋白水解度随着反应时间增长而增大，当时间达到一定值后水解度的增大变缓；在水解体系加酶量一定时，乳清蛋白水解度随着温度增加而增加，当温度达到一定时水解度开始下降。在适当中间区域的反应时间和温度两种因素交互作用下，可获得水解度较高的酶解产物。

同样，由图7和8可看出，水解温度与加酶量、水解时间和加酶量等之间的关系均与图6水解温度和水解时间的分析结果类似。

2.5 酶解乳清蛋白最佳水解条件确定

为进一步确定乳清蛋白最佳酶解条件，对回归方程取一阶偏导数为零整理得：

联立上述3个方程求解，得到极值点X1＝0.324、X2＝0.794、X3＝1.607。换算后得乳清蛋白最优酶解条件，即在反应温度56.62℃、加酶量为8 213.77U/g·蛋白条件下，木瓜蛋白酶水解乳清蛋白113.83min时能获得最大水解度，其最大水解度为11.60%。考虑到实验可操作性，验证实验在反应温度57℃、加酶量8 214U/g·蛋白、水解时间114 min条件下进行，所得到乳清蛋白水解度为11.72%，与模型值（11.60%）相符。

图6 水解温度和水解时间对水解度的交互影响Figure 6 Mutual influence of temperature and time on DH

图7 水解温度和加酶量对水解度的交互影响Figure 7 Mutual influence of temperature and enzyme dosage on DH

图8 水解时间和加酶量对水解度的交互影响Figure 8 Mutual influence of time and enzyme dosage on DH

3 结论

为更好地提高乳清蛋白酶解产物的利用率和营养价值，本研究比较了乳清蛋白在不同预处理方式下酶解程度，分析了酶切位点相异的蛋白酶自然pH下对乳清蛋白的酶解效果，并通过正交旋转回归设计优化了乳清蛋白的酶解条件。研究表明乳清蛋白水溶液经80℃10min预处理后，加入8 214U/g·蛋白的木瓜蛋白酶，57℃水解114min后能获得最大水解度。以往关于酶解乳清蛋白的研究，都是控制蛋白酶在其各自最适pH下且未考虑预处理对水解产物的影响，这势必会影响到乳清蛋白在食品中的应用。本研究不仅提高了乳清蛋白酶解效率，同时还可将其酶解产物—乳清蛋白肽直接地应用于液态乳制品等功能性食品中。

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