间歇性低温刺激减少载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块内胶原含量的研究

郑曦，杨永健，孙梅芹，马双陶，张立平，王强，叶挺巧

间歇性低温刺激减少载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块内胶原含量的研究

郑曦，杨永健，孙梅芹，马双陶，张立平，王强，叶挺巧

目的：研究间歇性低温刺激对载脂蛋白E（ApoE-/-）基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块内胶原含量的影响。

方法：20只8周龄的雄性ApoE-/-小鼠被随机分为对照组和实验组，实验组小鼠每天8：00至12：00置于（4±1）°C环境中，其余时间和对照组小鼠一样处于（24±2）°C环境。饲养12周后，Masson染色了解小鼠主动脉根部动脉粥样硬化斑块内胶原情况，蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测小鼠主动脉基质金属蛋白酶（MMPs）2、9及基质金属蛋白酶抑制剂1的表达情况。

结果：Masson染色见实验组小鼠主动脉根部斑块内胶原含量低于对照组，Western blot实验组小鼠主动脉MMP2、MMP9表达高于对照组，TIMP1表达低于对照组。

结论：间歇性低温刺激可能通过破坏MMPs/TIMPs之间的平衡，引起动脉粥样硬化斑块内胶原含量减少，造成易损斑块的形成，导致急性冠状动脉综合征的发生。

间歇性低温；动脉粥样硬化；基质金属蛋白酶；胶原；易损斑块

Methods: A total of 20 male ApoE-/-mice at 8 weeks of age were divided into 2 groups: Experimental group, the mice had intermittent cold exposure at (4 ± 1)°C from 8am to 12noon and Control group, the mice were living at (24 ± 2) °C. All animals were treated for 12 weeks, n=10 in each group. The collagen content of atherosclerotic plaque at the aortic root in ApoE-/-mice was observed by Masson staining, the protein expressions of aortic MMP-2, MMP-9 and TⅠMP-1 were examined by Western blot analysis.

Results: Compared with Control group, the Experimental group presented the lower collagen content of atherosclerotic plaque at the aortic root, higher protein expressions of MMP-2, MMP-9 and lower protein expression of TⅠMⅠ 1.

Conclusion: Ⅰntermittent cold stress may disturb the balance of MMP/TⅠMP and decrease collagen content of atherosclerotic plaque to form vulnerable plaque in experimental ApoE-/-mice which may cause acute coronary syndrome.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:68.)

急性冠状动脉综合征（ACS）是目前造成人类死亡的重要原因。流行病学调查研究显示在寒冷的冬天，冠心病的死亡率会增加[1,2]。最近的一项研究显示，在中国，严重的低温天气会增加缺血性心脏病的死亡风险[3]。虽然已经观察到低温与冠心病猝死之间的联系，但是其引起冠心病急性发作的确切机制尚不明确。动脉粥样硬化斑块的破裂通常会导致冠心病急性事件的发生。有破裂倾向的冠状动脉粥样硬化斑块被称作为易损斑块，其主要特征是斑块的坏死中心表面覆盖着一层薄的纤维帽。易损斑块的纤维帽含有较少的胶原纤维[4]。基质金属蛋白酶（MMPs）削弱纤维帽从而导致斑块的不稳定，而基质金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）可以负向调节基质金属蛋白酶活性，两者协同控制胶原纤维的表达[5]。本实验旨在探讨间歇性低温刺激对斑块稳定性的影响。

1 材料和方法

实验动物及试剂：2013-08至2013-12选择20只遗传背景为C57BL/6J的8周龄雄性载脂蛋白E（ApoE-/-）小鼠，体重21～24g，购于北京医科利昊生物科技有限公司。兔抗小鼠MMP2、MMP9、TIMP1抗体购自武汉博士德公司，Masson三色染色液购于南京建成生物有限公司，甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）试剂盒购于北京北化康泰试剂有限公司，全蛋白提取试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司，蛋白浓度测定试剂盒购于碧云天生物科技研究所。

实验动物的分组、干预及取材：20只遗传背景为C57BL/6J的8周龄雄性ApoE-/-小鼠被随机分为对照组及实验组，每组10只。对照组小鼠全天饲养于环境温度为（24 ± 2）℃的清洁级动物房中。实验组小鼠同样饲养于温控清洁级动物房中，每日有4小时（8:00 am to 12:00 am）处于（4 ± 1）℃中，其余时间处于（24 ± 2）℃的环境中。12周的低温干预后开始取材。取小鼠的血浆、心脏（包含主动脉根部组织）及胸腹主动脉。

体重、血糖、血脂的测定：12周后用电子秤给每只小鼠称体重，使用罗氏血糖检测仪检测小鼠的血糖，从小鼠颈静脉处收集血液标本，3000转/分，离心10分钟，取血浆，按血脂试剂盒使用说明进行操作[6]。

Masson染色检测小鼠主动脉根部斑块内胶原含量：4%的多聚甲醛固定小鼠心脏（包含主动脉根部），脱水，包埋，切片（一边切一边镜下观察，发现主动脉根部出现完整的瓣膜后开始连续切片），常规脱蜡、水化、脱水，使用快速Masson染液染色试剂盒，按试剂盒说明书操作，封片，镜下观察,图中蓝色区域表示胶原纤维，并使用IPP软件对图像进行分析。

蛋白免疫印迹法（Western blot）检测小鼠主动脉MMP2、MMP9、TIMP1的表达：取小鼠胸腹主动脉，进行全蛋白提取，然后是蛋白浓度测定[7]，配胶，上样，电泳，转膜，封闭，分别加入兔抗小鼠MMP2、MMP9、TIMP1抗体，洗涤，加II抗，洗涤，显像。

统计学处理：计量资料以均数±标准误表示。使用 Graph Pad Prism 4统计软件处理数据，用独立样本t检验进行组间比较。P＜0. 05认为组间差异有统计学意义。

2 结果

2.1 间歇性低温刺激对两组ApoE-/-小鼠体重、血糖、血脂的影响

12周的低温干预后两组间小鼠体重, 血糖,TG,TC,LDL-C,HDL-C差异无统计学意义（P＞0.05）。表1

表1 间歇性低温刺激对两组ApoE-/-小鼠体重、血糖、血脂的影响（±Se）

2.2 间歇性低温刺激对两组ApoE-/-小鼠斑块内胶原含量的影响

12周的低温干预后，实验组小鼠主动脉根部动脉粥样硬化斑块内胶原含量低于对照组 （图1A,1B,1C），差异有统计学意义（t=4.28，P＜0.01）。

2.3 间歇性低温刺激对两组ApoE-/-小鼠主动脉内MMP2、MMP9、TIMP1的影响

12周的低温干预后，实验组小鼠主动脉

MMP2、MMP9的表达量大于对照组,差异有统计学意义（t=3.99，P＜0.01和t=3.02，P＜0.05），TIMP1的表达量小于对照组，差异有统计学意义（t=2.69，P＜0.05）。图2A，2B

图1 间歇性低温对两组ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块内胶原含量的影响

图2 间歇性低温刺激对两组ApoE-/-小鼠主动脉MMP2、MMP9及TIMP1的影响

3 讨论

低温天气会增加急性冠状动脉综合征的发病率及死亡率，但其具体机制尚不是十分明确。目前的研究显示，间歇性低温刺激会引起ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块内胶原含量的减少，造成主动脉内MMP2、MMP9的表达上升和TIMP1的表达下降。

大量的研究证明，易损斑块的形成是导致急性冠状动脉综合征的重要原因。斑块内纤维帽的厚度决定动脉粥样硬化斑块的稳定性。纤维帽是斑块内脂质成分与血液的屏障，其主要作用是维持斑块的结构完整从而起到抵抗血流冲击，防止斑块的破裂及继发血栓形成。而胶原是动脉粥样硬化斑块内纤维帽的主要成分之一。胶原纤维的含量影响纤维帽的厚度。我们的研究表明，在经过12周的低温刺激后，实验组小鼠斑块内胶原含量低于对照组。

糖脂代谢异常是动脉粥样硬化发生、发展的重要因素。已经有研究证实，体内代谢的紊乱，比如肥胖、高血糖、高血脂会促进动脉粥样硬化斑块的生长并导致斑块的不稳定。Kozyreva等[8]的研究报告显示，对于高血压或者血压正常的大鼠，冷应激会引起大鼠体内血浆LDL的明显下降和HDL的明显上升。然而最近的一项研究发现[9]，将ApoE-/-小鼠和LDL受体缺陷小鼠置于4℃环境中，8周后，其血浆TC和HDL-C较对照组明显升高。出现这样的结果，或许与实验所采取的温度、实验持续的时间、冷却速度以及实验动物的基因背景不同有关系。目前的实验显示，在12周的低温干预后，两组间小鼠的体重、血糖、血脂没有明显的差异。目前的研究显示间歇性低温刺激导致斑块的不稳定与小鼠体内的糖脂代谢无关。

MMPs降解细胞外基质，通过对动脉粥样硬化斑块内胶原纤维的降解，削弱纤维帽，造成斑块的不稳定，而TIMPs表达增加能够抑制MMPs活性，阻止斑块破裂，增加动脉粥样硬化斑块稳定性[10]。目前认为MMPs是低温导致动脉粥样硬化斑块进展的重要调节因子。在易损斑块中，炎性细胞分泌MMPs增多，破坏斑块的稳定结构，导致急性冠状动脉事件的发生。我们的实验同样发现，低温导致动脉粥样

硬化斑块失稳的同时，主动脉中MMP2、MMP9的表达上升，而TIMP1的表达量下降。研究结果表明，MMPs与TIMPs之间的失衡是间歇性低温刺激导致斑块的不稳定性的重要因素。因此，在临床工作中，恢复MMPs与TIMPs之间的平衡是预防低温促进斑块破裂的一个有效方法。

总之，目前的实验表明，间歇性低温刺激通过造成MMP2、MMP9与TIMP1之间的失衡，减少斑块内胶原含量，导致斑块的不稳定。目前的研究结果对阐明低温刺激造成急性冠状动脉综合征的发病率及死亡率增加的机制提供新思路。

[1] Bhaskaran K, Hajat S, Haines A, et al. Effects of ambient temperature on the incidence of myocardial infarction. Heart, 2009, 95: 1760-1769.

[2] Barnett AG, Dobson AJ, McElduff P, et al. Cold periods and coronary events: an analysis of populations worldwide. J Epidemiol Community Health, 2005, 59: 551-557.

[3] Guo Y, Li S, Zhang Y, et al. Extremely cold and hot temperatures increase the risk of ischaemic heart disease mortality: epidemiological evidence from China. Heart, 2013, 99: 195-203.

[4] 陈韵岱. 急性冠脉综合征易损斑块的研究进展. 中国循环杂志, 2007, 10: 390-392.

[5] Jones CB, Sane DC, Herrington DM, Matrix metalloproteinases:a review of their structure and role in acute coronary syndrome. Cardiovasc Res, 2003, 59: 812-823.

[6] Jiang S, Jin F, Li D, et al.Intermittent hypobaric hypoxia promotes atherosclerotic plaque instability in ApoE-deficient mice. High Alt Med Biol, 2013, 14: 175-180.

[7] Ma S, Yang D, Li D, et al. Cardiac extracellular matrix tenascin-C deposition during fibronectin degradation. Biochem Biophys Res Commun, 2011, 409: 321-327.

[8] Kozyreva TV, Lomakina SV, Tuzikov FV, et al. Plasma lipoproteins under the effect of cold exposure in normotensive and hypertensive rats. J Therm Biol, 2004, 29: 67-72.

[9] Dong M, Yang X, Lim S, et al. Cold exposure promotes atherosclerotic plaque growth and instability via UCP1-dependent lipolysis. Cell Metab, 2013, 18: 118-129.

[10] 黄文军, 刘俊明, 高霞, 等. 血清基质金属蛋白酶 -2（MMP-2）和MMP-9与急性冠状动脉综合征的相关研究. 中国循环杂志, 2013, 4: 103-106.

Intermittent Cold Stress Reducing the Collagen Content of Atherosclerotic Plaque in Experimental ApoE-/-Mice

ZHENG Xi, YANG Yong-jian, SUN Mei-qin, MA Shuang-tao, ZHANG Li-ping, WANG Qiang, YE Ting-qiao.
Department of Cardiology, General Hospital of PLA Chengdu Military Area Command, Chengdu (610083) Sichuan, China
Co-corresponding Authors: YANG Yong-jian, Email: yongjiany@yahoo.cn and SUN Mei-qin, Email: meiqinsun@163.com

Objective: To investigate the influence of intermittent cold stress on collagen content of atherosclerotic plaque in experimental ApoE-/-mice.

Ⅰntermittent cold stress; Atherosclerosis; Matrix metalloproteinase (MMP); Collagen; Vulnerable plaque

2014-04-27）

（编辑：汪碧蓉）

610083 四川省成都市，中国人民解放军成都军区总医院 心血管内科

郑曦 住院医师 硕士 研究方向：动脉粥样硬化的基础与临床 Email：zheng71466667@126.com 通讯作者：杨永健 Email：yongjiany@yahoo.cn孙梅芹 Email：meiqinsun@163.com

R54

A

1000-3614( 2015 )01-0068-04

10.3969/ j. issn. 1000-3614. 2015.01.018