氯化钴诱导SH-SY5Y细胞缺氧损伤作用的研究

邹荣军，梁祖凤，石婉婷，朱悦诚，李秋凤，郭 馨，田 晶

(吉林医药学院:1.临床医学院，2.公共卫生学院，3.生理教研室，吉林吉林 132013)

氯化钴诱导SH-SY5Y细胞缺氧损伤作用的研究

邹荣军1，梁祖凤2，石婉婷1，朱悦诚1，李秋凤1，郭 馨1，田 晶3*

(吉林医药学院:1.临床医学院，2.公共卫生学院，3.生理教研室，吉林吉林 132013)

目的 探讨氯化钴(CoCl2)诱导SH-SY5Y细胞缺氧损伤的作用及相关机制。方法 用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)观察不同浓度CoCl2对SH-SY5Y细胞生长情况影响;ELISA法检测细胞内相关凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3及缺氧相关蛋白HIF-1α的表达情况。结果 CoCl2可以诱导SH-SY5Y细胞损伤，并呈现浓度和时间依赖性;CoCl2作用于SH-Y5Y细胞导致HIF-1α、Caspace-3和Bax的表达增多(P＜0.05)，Bcl-2表达减少(P＜0.01)。结论 CoCl2诱导SH-SY5Y细胞缺氧损伤与上调HIF-1α表达、促进细胞凋亡有关。

CoCl2;SH-SY5Y细胞;缺氧模型

Key words:CoCl2;SH-SY5Y cells;hypoxiamodel

缺血性脑血管疾病(Ischemic cerebral vascular disease，ICVD)因发病率高、致残率高，与心脏病、恶性肿瘤一起构成了人类的三大致死性疾病。美国流行病学研究［1］预测，到2030年发达国家65岁以上老年人当中将会有1/5的人患此疾病。缺血性脑血管病发生时，缺血会直接引起神经细胞的缺氧损伤，引起神经细胞的凋亡、结构改变和功能减退，这与癫痫、阿尔茨海默症、帕金森等多种疾病密切相关。氯化钴(CoCl2)因使用方便、理化性质稳定成为诱导细胞缺氧损伤首选药物，在各类肿瘤、视网膜疾病、脑血管疾病等研究中都发挥了重要作用。SH-SY5Y细胞是人神经母细胞瘤细胞，在结构和功能上与神经元极为相似，在实验研究过程中常将其作为神经元的替代细胞，因此在研究ICVD中也有一定的代表意义［2］。查阅文献发现，对CoCl2诱导SHS-Y5Y细胞化学缺氧损伤的报道少，机制尚未明确。本实验以人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞为研究对象，用不同浓度CoCl2处理不同时间段诱导SH-SY5Y神经细胞损伤，探究其分子机制，分析其在建立缺血性脑血管疾病模型的应用价值。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

CoCl2、MTT、胰蛋白酶均购自美国Sigma公司; DMEM培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司;缺氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible fator 1α，HIF-1α)、Caspase-3、B细胞淋巴瘤蛋白-2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bax抗体及酶标山羊抗兔lgG抗体均购自北京中杉公司;二甲基亚砜(DMSO)由天津市大茂化学试剂厂提供;细胞培养箱，北京东方安若生化科技有限公司生产;酶标仪，美国Bio-Rad公司生产。

1.2 细胞培养

人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞由吉林医药学院生化教研室李妍博士赠送。细胞培养基为含体积分数为10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，置于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中常规培养，细胞呈贴壁生长，每2～3 d换液1次，倒置显微镜下观察细胞生长状况并拍照，待细胞长至80%之后进行传代。

1.3 MTT比色法检测细胞增殖情况

取对数生长期的SH-SY5Y细胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成密度为5×104/mL的细胞悬液，以每孔100μL接种于96孔板中，置于培养箱中常规培养。待细胞贴壁后分组，对照组加入200μL无血清培养基，实验组分别加入含CoCl2浓度为100、200及400μmol/L的无血清培养基，并分别作用12、24及48 h。终止时每孔加入20μLMTT，37℃孵育4 h，弃上清后每孔加入150μL DMSO，低速震荡10 min，酶标仪490 nm波长测得吸光度值并记录结果。

1.4 ELISA法检测相关凋亡蛋白表达

将收集上清液与包被液按1∶1比例加入到96孔板中，对照组为100%包被液，每孔200μL/L。封闭液封闭1.5 h，PBST洗净后加入一抗(稀释倍数1∶1 000)孵育过夜，PBST洗净后加入二抗室温孵育1.5 h，显色、终止，酶标仪490 nm波长测得吸光度值并记录结果。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 CoCl2诱导SH-SY5Y细胞损伤的评价

CoCl2可以引起SH-SY5Y细胞的损伤，并具有时间和剂量依赖性。CoCl2处理时间越长、浓度越高，对SH-SY5Y细胞的损伤越明显(图1)。

图1 不同浓度的CoCl2作用不同时间后对SH-SY5Y细胞增殖的影响

2.2 CoCl2诱导SH-SY5Y细胞损伤相关凋亡蛋白的表达

200μmol/L CoCl2作用SH-SY5Y细胞24 h后采用ELISA法测得空白组(control)与模型组(treacted group)相关蛋白的表达情况，结果表明:与空白组相比模型组HIF-1α、Caspace-3和Bax表达增多(P＜0.05)，Bcl-2表达减少(P＜0.01)(图2)。

图2 CoCl2处理SH-SY5Y细胞后相关凋亡蛋白表达情况

3 讨论

大量的研究发现，缺血性脑病的发生与大脑缺血缺氧后神经细胞内氧自由基的形成、Ca2+超载、凋亡调控基因的激活、MPTP开放和内质网应激等方面变化导致神经细胞凋亡有关［3］，临床上表现为肢体运动障碍、失语、记忆力减退、精神萎靡、行为异常等症状。缺血性脑病的治疗依然依靠药物治疗，因此建立稳定缺氧模型用作药物研究至关重要。本研究中发现应用 CoCl2建立缺氧模型，CoCl2可以诱导 SHSY5Y细胞的损伤、抑制增殖，并具有时间和剂量依赖性。CoCl2处理时间越长、浓度越高对SH-SY5Y细胞的损伤及抑制越明显。目前研究发现，CoCl2诱导神经细胞缺氧损伤的机制:一方面Co2+可置换神经细胞内的氧感受器类血红素蛋白及一些催化酶中的Fe2+，使细胞内类血红素不能和氧结合而保持脱氧状态，从而模拟缺氧［4］;另一方面CoCl2作用细胞后会使HIF-1α表达增多，HIF-1α具有双面作用，一定条件下可使神经细胞产生缺氧耐受能力，超出细胞调节能力后又可导致其产生缺氧损伤［5-7］;此外最重要的是CoCl2作用细胞后会产生氧自由基蓄积，能够导致胞浆内Ca2+超载、丝裂原蛋白(MAPK)异常活化及Bcl-2家族凋亡蛋白表达异常等变化，继而导致线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeablity pore，MPTP)开放、内质网应激和caspases级联反应系统激活［8］。因此，采用CoCl2建立ICVD体外模型比较稳定，效果理想且符合疾病发生的分子机制，是相对理想的造模药物。

本研究中发现在用200μmol/L CoCl2作用SHSY5Y细胞24 h后HIF-1α、Caspace-3和Bax的表达增多，Bcl-2表达减少。因此，CoCl2诱导SH-SY5Y细胞缺氧损伤可能与HIF-1α表达增多，Bax/Bcl-2比值增高，继而导致Caspase系统激活引起细胞凋亡有关。这些结果与脑缺氧损伤的变化是相符的，因此可以应用CoCl2在SH-SY5Y细胞上建立缺氧模型用于药物研究。体外采用氯化钴诱导化学缺氧致SHSY5Y细胞损伤的实验模型简单、易于操作、重复性好，可较好模拟体内缺氧/缺血状态，对缺血性脑病治疗药物的开发具有重要意义。

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Cobalt chloride induced hypoxia on SH-SY5Y cells

ZOU Rongjun1，LIANG Zufeng2，SHIWanting1，ZHU Yuecheng1，LIQiufeng1，GUO Xin1，TIAN Jing3*
(1.Clinical Medical College，2.School of Public Health，3.Department of Physiology，Jilin Medical College，Jilin City，Jilin Province，132013，China)

Objective To investigate the hypoxia injury and mechanism of Cobalt chloride(CoCl2)on SH-SY5Y cells.Methods Different doses of CoCl2were used to treat SH-SY5Y cells，MTT assay was employed to examine the growth of the cells.ELISA was used to detect the expressions of Bax，Bcl-2，Caspase-3 and HIF-1α.Results The inhibitory effect of CoCl2was appeared in a time and dosage dependentmanner.CoCl2could increase the expression of Caspase-3，Bax and HIF-1α(P＜0.05)，while reduce the expression of Bcl-2(P＜0.01).Conclusion CoCl2could induce hypoxia on SH-SY5Y cells by up-regulating HIF-1αand inducing apoptosis.

R743.3

A

1673-2995(2015)01-0012-03

2014-11-11)

吉林省教育厅项目(2014369);吉林省大学生创新创业训练项目(2013845).

邹荣军(1991－)，男(汉族)，本科在读.

田 晶(1973－)，女(汉族)，副教授，硕士.