突变敏感性分子开关检测肺炎支原体对大环内酯类抗生素的耐药性研究

刘 艳，刘 丹，朱翠明，黄泽智，蒙松年，唐翠莲

2.湖南省邵阳市疾病预防控制中心，邵阳 422000；

3.南华大学病原生物学研究所，衡阳 421001

肺炎支原体（Mycoplasmapneumoniae，Mp）是社区获得性肺炎（CAP）最主要的病原体[1]，主要通过呼吸道传播，在儿童和青少年中，10%～30%的CAP是由Mp感染所致，流行期间可高达40%～50%[2－3]。此外，Mp感染还可引起鼻炎、咽炎、支气管炎、气管炎等呼吸系统常见疾病，并与小儿哮喘的发病密切相关[1－3]。目前儿科治疗 Mp感染一般首选大环内酯类药物，如红霉素、罗红霉素、泰利霉素（14元环）、阿奇霉素（15元环）、交沙霉素（16元环）等。近年来，Mp对大环内酯类抗生素的耐药日趋严重，多国均已分离出耐大环内酯类抗生素的Mp株，其中德国约2.0%的 Mp分离株对大环内酯类抗生素耐药[4－5]，法国分离的耐药株约为3.6%[4，6]，美国约 为 7.0%[4，7－8]，日 本 约 为 10.9%[3－4，9－11]，而我国70%以上的Mp分离株对大环内酯类抗生素耐药[4，12－17]。临床上为避免抗生素滥用，在使用大环内酯类抗生素治疗Mp感染时常需借助于药敏试验，根据药敏试验结果来合理使用抗生素。药敏试验首先必须从临床标本中分离培养出Mp，由于Mp的培养特点是营养要求高、生长缓慢（初次培养需10～30d），加之培养阳性率低，且阳性株行药敏试验还需5～7d，所以，Mp的常规药敏试验仅适合于回顾性诊断及研究。因此，寻找一种快速检测 Mp药物敏感性的方法对指导临床合理用药治疗Mp感染具有重要的意义。

目前，对Mp的耐药机制研究仅发现了作用靶位基因突变，即由于23SrRNA（Mp的基因组相对较小，仅有一个rRNA操纵子）与抗生素直接结合的碱基点突变导致抗生素与核糖体亲和力下降而引起耐药[4－18]。目前Mp临床分离耐药株中尙未检测到23SrRNAⅡ区及核糖体蛋白L4、L22突变（体外用抗生素诱导时偶有突变），耐药Mp株的突变出现在23SrRNAⅤ区，表现为2063，2064和2617位的碱基点突变[4－17]，因此通过检测 Mp 23SrRNAⅤ区基因是否发生突变，可了解Mp对大环内酯类抗生素的敏感性。

目前，检测Mp 23SrRNA基因突变的方法很多，如基因测序[19－20]、限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）[21]、单链构象多态性分析（single strand conformation polymorphism，SSCP）[13]、高分辨率溶解曲线分析（high resolution melting，HRM）[5－6，23]等，但这些检测方法或灵敏度差，或耗时费力，或需昂贵的设备，无法在基层普及应用。因此，课题组拟寻找一种快速、简便、高敏感、高准确性的突变检测技术来检测23SrRNA基因的变异。

1 材料与方法

1.1 标本来源 40株Mp临床分离株，均来自临床急性呼吸道感染患儿的呼吸道咽拭子标本，为前期分离培养鉴定的临床菌种，冷冻保存；Mp标准株ATCC 15531，由南华大学病原生物学研究所馈赠。

1.2 方法

1.2.1 微量稀释法测定MIC值 将冻存的Mp临床分离株置于室温溶解，用微量稀释法测定其对5种大环内酯类抗生素（红霉素、罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、交沙霉素，均为中国药品生物制品检定所标准品）的MIC值。

1.2.2 建立高保真聚合酶和3′硫化修饰引物的分子开关，并用分子开关检测23SrRNA V区2063／2064、2617基因是否发生突变。

1.2.2.1 Mp基因组DNA的抽提 将冷冻保存的Mp临床分离株取出进行传代复苏，待生长时间比较稳定（约7d）后，吸取20μL菌液加入到1.5mL的离心管中，离心（13 000×g）10min，弃上清液，再加标本处理液200μL，混匀，100。C的沸水中水浴10min，此液作为DNA模板备用。

1.2.2.2 硫化修饰引物的设计 上游野生型引物设计：A2063G／C和A2064G的突变均可导致红霉素高水平耐药，而C2617G／A的突变可引起红霉素、阿奇霉素、泰利霉素的低水平耐药，因此，依据耐药碱基是否突变来判断Mp对大环内酯类抗生素的敏感性时，仅需区分2063／2064位或2067位突变，不需区分2063与2064位突变，也勿需了解突变类型即可了解Mp对大环内酯类抗生素的敏感性。由于硫化修饰引物3′末端上游不配对碱基均不能被exo＋高保真酶延伸，故只需设计2对针对Mp敏感株的3′末端硫化修饰引物（野生型引物）即可，一对用于检测2063／2064位碱基突变，另一对用于检测2617位点突变。

下游引物设计：为避免单引物PCR扩增，不在反向重复序列区域设计下游引物，同时控制扩增循环次数、提高退火温度，使单引物仅能扩增出大小不等、低丰度的单链DNA产物甚至不扩增。因为琼脂糖凝胶电泳分辨率较低，所以检测结果表现为“关”的效应。硫化修饰引物序列详见表1。

表1 23SrRNA V区2063／2064、2617基因硫化修饰引物Tab.1 Phosphorothioate modification of the 2063／2064and 2617in domain V of M.pneumoniae 23SrRNA genes

1.2.2.3 PCR扩增目的基因片段 反应体系为：双蒸水8.5μL，2×PCR Mix 12.5μL，上下游引物各1μL，DNA模板2μL。反应条件为：94。C预变性10min→94。C变性1min→65。C退火45s→72。C延伸45s的PCR循环，共30个循环，最后72。C延伸10min，4。C终止反应。

1.2.2.4 PCR产物的电泳及结果判断 对PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测其是否有目的片段来判断23SrRNA V区2063／2064、2617基因是否发生突变。

1.2.3 普 通 PCR 扩 增 23SrRNA V 区 2063／2064、2617基因，并将扩增产物送上海生工进行基因测序，用BLAST软件分析序列，检查是否发生基因突变。

1.2.3.1 Mp基因组 DNA的抽提 同1.2.2.1

1.2.3.2 PCR扩增目的基因片段及DNA测序参考Lucier等[23]报道的扩增23SrRNAⅤ区的引物序列，由上海生工合成，引物序列见表2。反应体系为：双蒸水8.5μL，2×PCR Mix 12.5μL，上下游引物各1μL，DNA模板2μL。反应条件为：94。C预变性10min→94。C变性1min→65。C退火45s→72。C延伸45s的PCR循环，共30个循环，最后72。C延伸10min，4。C终止反应。对扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测其是否有目的片段，并对阳性产物进行纯化，送上海生工测序。最后利用BLAST软件将测序结果与GenBank上所收录的编码序列进行比较分析，检查是否发生碱基突变。

表2 普通PCR扩增23SrRNAⅤ区2063／2064、2617基因的引物Tab.2 Primers of the 2063／2064and 2617in domain V of M.pneumoniae 23SrRNA genes for ordinary PCR amplification

2 结 果

2.1 40株Mp临床株中，38株对红霉素耐药（MIC≥128mg／L），耐药率为95.00%（38／40）。5种大环内酯类抗生素中，Mp对15元环的阿奇霉素、交沙霉素相对敏感，其中对交沙霉素的敏感性最高，其MIC≤4mg／L。

2.2 分子开关检测Mp 23SrRNA基因突变 分别在不同的反应体系中应用分子开关快速检测 Mp 23SrRNA基因的2063、2064和2617位的碱基是否发生突变。在不同的反应体系中，应用分子开关进行PCR扩增，以琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。当引物与模板完全配对时（即无碱基突变时），分子开关表现为“开”，引物被延伸，生成特异性PCR产物；当引物与模板不完全配对时（即有碱基突变时），分子开关处于“关”，引物不能被延伸，无特异性PCR产物生成。

40株Mp临床株分别用2063／2064、2617位野生型（未突变）的硫化修饰引物，使用高保真酶进行PCR扩增，其中有2株Mp临床株扩增出大小约200bp的产物，38株Mp临床株未扩增出200bp的产物（图1）；40株 Mp临床株均扩增出大小约220bp的产物（图2）。即38株 Mp临床株的23S rRNA的2063或2064位发生了基因突变，40株Mp临床株的2617位均未发生基因突变。

图1 分子开关检测2063／2064基因突变结果Fig.1 Results of the on／off switches detecting the 23SrRNA gene mutations at position 2 063／2 064

图2 分子开关检测2617基因突变结果Fig.2 Results of the on／off switches detecting the 23SrRNA gene mutations at position 2 617

2.3 DNA测序分析Mp 23SrRNA基因突变

2.3.1 普通PCR扩增包含突变位点的基因序列用普通PCR分别扩增含 Mp 23SrRNA 2063／2064、2617位点的基因片段，自40例临床标本中均扩增出210bp、496bp的基因片段，见图3、图4。

2.3.2 PCR产物DNA分析 扩增出的PCR产物经纯化后送上海生工测序，并将测序后的序列与M129（敏感标准株）进行BLAST序列比对分析，结果发现：40株Mp中有35株检测出A2063G的突变，3株检测出A2064G的突变，未发现2617位点突变。

图3 PCR扩增包含Mp 23SrRNA 2063／2064位点的基因片段Fig.3 PCR amplification of M.pneumoniae 23SrRNA gene mutations（containing position 2 063／2 064）

图4 PCR扩增包含Mp 23SrRNA 2617位点的基因片段Fig.4 PCR amplification of 23SrRNA gene mutations（containing position 2 617）

2.4 分子开关、基因测序检测耐药基因与大环内酯类抗生素的敏感性分析 用分子开关和基因测序2种不同方法均从40株Mp临床株中检测到38株发生了23SrRNA 2063／2064基因位点突变，这38株Mp临床株对红霉素呈高水平耐药，并对阿奇霉素、交沙霉素等大环内酯类抗生素产生交叉耐药性（见表3）。38株2063／2064基因位点突变的 Mp临床株对大环内酯类药物的MIC值：红霉素和克拉霉素为32～ ≥128mg／L，阿奇霉素为16～64mg／L，交沙霉素为0.0125～8mg／L。未发生突变的2株Mp临床株对大环内酯类抗生素均敏感，其对红霉素、克拉霉素、阿奇霉素和交沙霉素的MIC均为 ≤0.004mg／L。通过分子开关检测23SrRNAⅤ区基因是否有突变，可初步了解Mp对大环内酯类抗生素的敏感性。

3 讨 论

Mp是儿童和青少年发生急性呼吸道感染的重要病原体之一，在自然界中广泛存在，主要是通过空气、飞沫传播。由Mp引发的肺炎及各种肺外并发症，对儿童健康的危害非常大。对于儿童患者而言，大环内酯类抗生素是治疗Mp感染的首选药物，其中以红霉素及其衍生物最为常用，但近年来的研究发现，耐大环内酯类抗生素的Mp临床株日趋增多[22]。

表3 分子开关、基因测序检测耐药基因及其与大环内酯类抗生素敏感性的相关性分析Tab.3 On／off switches，resistant gene detection by DNA sequencing and the correlation assays of the susceptibility of M.pneumoniaeto macrolide antibiotics

Mp对大环内酯类抗生素的耐药机制尙未发现灭活酶及药物主动外排系统，仅发现23SrRNA V区基因 A2063G／C，A2064G，C2617G／A的点突变导致抗生素与核糖体亲和力下降而引起耐药[4－18]。因此，通过检测23SrRNA基因可反应Mp对大环内酯类抗生素的敏感性。

2003年李凯教授发明的一种新的突变检测技术——基于高保真DNA聚合酶的分子开关，此分子开关由高保真DNA聚合酶与硫化修饰碱基特异性引物构成，可与电泳等多种现有的技术联合使用，检测单一或多个已知单碱基多态性位点。高保真DNA聚合酶既有5′→3′DNA聚合酶活性，亦具3′→5′外切酶活性，能从3′→5′方向识别不匹配的DNA链末端的核苷酸并进行校正。研究发现，对硫化修饰的碱基特异性引物而言，高保真DNA聚合酶分子中的聚合中心和3′→5′外切酶酶解中心既合作又独立地起到了复合分子开关中“开”和“关”的作用。即：当硫化修饰引物与模板完全匹配时，分子开关表现为“开”的状态，引物被延伸，有特异性扩增产物生成；当引物与模板不完全匹配时，分子开关将处于“关”的状态，引物则不能被延伸，无特异性扩增产物产生。用分子开关进行PCR扩增，联合琼脂糖电泳分析结果时，可以根据有无特异性的扩增产物来判断是否存在碱基突变。与现有的突变检测方法相比，由高保真DNA聚合酶与硫化修饰碱基特异性引物所构成分子开关具有以下6个特点：①快速：整个实验耗时通常小于4h；②简单：通过琼脂糖凝胶上的条带或直接观察荧光信号即可分析；③准确：该分子开关表现出引物与模板匹配则引物被延伸、不匹配则引物不延伸的“开”、“关”效应，准确度高；④检测成本低：不需要昂贵的仪器设备；⑤经多重PCR扩增，对不同的突变位点或突变类型可在同一反应体系中进行分析；⑥可大范围推广：该分子开关与PCR、RT－qPCR相结合，能大范围在基层医疗机构中推广使用。目前，此分子开关已成功用于多种基因突变的检测，如检测线粒体16SrRNA A1555G和 C1494T 的突变[24]。

本研究构建了高保真DNA聚合酶和3′硫化修饰引物的分子开关，分别在不同反应体系中快速检测 Mp 23SrRNA基因的2063／2064和2617位的碱基是否发生突变，检测结果与DNA测序结果一致，40株 Mp中有38株发生了23SrRNA 2063／2064基因位点突变，且这38株Mp对红霉素呈高水平耐药，对阿奇霉素、交沙霉素等大环内酯类抗生素产生交叉耐药性。Mp对大环内酯类抗生素的MIC值：红霉素、克拉霉素为32～≥128mg／L，阿奇霉素为16～64mg／L，交沙霉素为0.012 5～8mg／L。2株Mp临床株未检测出突变，对大环内酯类抗生素均敏感，红霉素、克拉霉素、阿奇霉素和交沙霉素的 MIC均 为≤0.004mg／L。因此，通过分子开关检测23SrRNAⅤ区基因是否发生突变，可初步了解Mp对大环内酯类抗生素的敏感性。

本研究是应用分子开关在不同反应体系中检测Mp 23SrRNA基因2063／2064及2617位的碱基是否发生突变，以后我们将在同一反应体系中，依据特异性扩增片段的有无和片段的大小来检测2063、2064和2617 3个位点突变，或用分子开关进行荧光定量PCR，在同一反应体系或不同反应体系中依据荧光信号的有无确定是否有突变，根据荧光信号的颜色确定是否有突变及突变位点。

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