DOM结构特征及其对17β-雌二醇光降解的影响

任 东，杨小霞，马晓冬，顾丽鹏，黄 斌，潘学军 （昆明理工大学环境科学与工程学院，云南 昆明 650500）

DOM结构特征及其对17β-雌二醇光降解的影响

任 东，杨小霞，马晓冬，顾丽鹏，黄 斌*，潘学军 （昆明理工大学环境科学与工程学院，云南 昆明 650500）

参照国际腐殖酸协会（IHSS）推荐的方法从滇池底泥提取出胡敏酸（HA）和富里酸（FA），以Sigma Aldrich胡敏酸（SAHA）为参照，利用元素分析、13C核磁共振和紫外-可见光谱对HA和FA的来源和结构进行了表征，并探讨了3种溶解性有机质（DOM）对17β-雌二醇（E2）光降解的影响.结果表明:HA、FA和SAHA具有相似的元素组成，3种腐殖酸的（N+O）/C值分别为0.50、0.82和0.55，与核磁共振13C谱分析的极性指数（0.32、0.42和0.33）一致.HA和FA来自于内源，具有较高的N含量和较多的缔合芳香结构，而SAHA是外源性有机质，具有更高的芳香度.低浓度的3种腐殖酸均能促进E2发生服从准一级动力学规律的光化学降解过程.E2在纯水中光降解速率为0.0071h-1，而在5mgC/L的HA、FA和SAHA作用下，E2光降解速率分别为0.0597、0.1178和0.2048h-1.3种腐殖酸促进E2光降解能力的差异主要是由含氧能团和芳香结构含量差异所致.活性氧分子探针鉴定显示HO·是腐殖酸体系受光照后产生的一种重要活性氧，其氧化降解E2的量占到了E2降解总量的70%左右.与低浓度腐殖酸相比，高浓度的3种腐殖酸均会对E2光降解产生抑制作用.

胡敏酸；富里酸；结构特征；17β-雌二醇；活性氧；光降解

溶解性有机质（DOM）是动植物残体经生物、化学及生物化学作用过程产生的一类分子量分布宽、结构复杂的异质溶解性有机混合物［1］，是地表水体中普遍存在的活跃组分.腐殖酸是溶解性有机质的主要组成部分，其包括胡敏酸（HA）和富里酸（FA），以有机碳含量计，腐殖酸的含量可占到环境地表水中溶解性有机碳总量的40%～80%［2］.腐殖酸能通过吸附、络合及分配等作用改变重金属和有机污染物的环境行为及生态毒性［3-5］，并因此受到了环境化学领域的广泛关注.此外，DOM的光化学过程对有机污染物光化学降解起着重要而复杂的介导作用，其为当前DOM环境光化学行为研究中所关注的焦点和热点.研究表明，胡敏酸可促进柱孢藻毒素、百菌清等有机污染物的光化学降解［6-7］；而Wenk等［8］发现腐殖酸会对苯胺、磺胺类物质的光化学降解过程产生相当的抑制作用，使得这些污染物在环境中大量积累，从而增加了这些物质的环境风险.

近年来，类固醇类雌激素（SEs）因给野生动物、人类健康及生态安全带来了既成或潜在的危害而受到全球关注［9-10］.光化学和微生物降解是SEs进入地表水环境系统后的主要消除途径［11］，但由于受微生物利用碳源的特异性及生长条件的限制，无论是在污水处理系统还是自然环境水体中，17β-雌二醇（E2）被微生物降解而被消除的过程均较为缓慢［12-13］.因此，光化学降解对环境水体中SEs的削减可能起着关键作用.同时，课题组前期研究调查也表明，光化学降解可能是滇池水体中SEs未发生大量积累的主要原因［14］.尽管SEs能够发生直接光降解［15-16］，但其直接光降解过程缓慢，半衰期，一般为几十至数百天［17］.然而，Zuo等［18］发现高仕利河口自然水体中的EE2能发生迅速的光降解过程，半衰期仅数十分钟，并推测EE2的光降解过程受到了水体中DOM、硝酸盐、Fe3+等多种组分的促进.因此，为了探究水环境中广泛存在的DOM对SEs光化学降解过程的影响，本研究按照国际腐殖酸协会（IHSS，http://www.ihss.gatech.edu/index.html）推荐的方法［19］从滇池底泥分离出FA和HA.采用元素分析、13C核磁共振和紫外-可见光谱技术对3种腐殖酸的组成和结构特性进行表征，并与Sigma Aldrich胡敏酸（SAHA）进行对比，以探讨不同来源和结构的腐殖酸对E2光降解过程的影响.由于SEs具有相似的分子结构，因此对E2在腐殖酸作用下光化学行为的研究有助于更为完整地认识SEs的环境行为.

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

试剂:NaOH、HCl、HF和KOH均为购自国药集团化学试剂有限公司的分析纯试剂，色谱纯异丙醇购自上海晶纯试剂有限公司，SAHA、分析纯Na4P2O7、DAX-8大孔树脂、Amberlite IR-120强酸性氢型阳离子树脂和E2标准品（纯度大于98%）均购买自Sigma Aldrich.E2的分子结构及其优化的3D结构模型如图1所示.实验用水均为超纯水（＞18.2MΩ·cm）.

图1 17β-雌二醇的分子结构及其优化的三维结构Fig.1 Molecular and optimized 3-dimensional structures of 17β-estradiol

主要仪器:南京胥江光化学反应仪（XPA-7G6），湖南湘仪L550低速离心机，日本Tokyo Rikakikai产FDU-1200冷冻干燥仪，美国Denver产TB-214精密电子天平（精度0.01mg），德国IKA产Vortex Genius 3型振荡混合器，德国Eppendorf移液器，美国Millipore 0.45μm玻璃纤维滤膜.

1.2 实验部分

1.2.1 腐殖酸获得及其溶液制备 于2014年3月7日从滇池10个地表水环境质量国控点采集20L底泥（5cm以下的部分）并冷藏运回实验室冷冻干燥，手工去除其中石砾和动植物残体等杂质，并研磨至2mm以下粒径后按照IHSS推荐的腐殖酸提取方法分离出FA和HA.按照HA和FA同样的提取方法对SAHA进行提纯并避光保存.

分别称取0.50g提纯的SAHA、HA和FA于具塞锥形瓶中，向HA和SAHA分别加入500mL 0.05mol/L NaOH溶液，FA加入500mL超纯水，于150次/min频率下振动24h.然后溶液在2327g下离心20min，将离心所得的上清液经预先灼烧4h的0.45μm玻璃纤维滤膜（GF/F）抽滤后作为SAHA、HA和FA母液.各母液采用德国Elementar Vario TOC cube测定有机碳浓度后于4℃下避光保存，以免其发生降解.

1.2.2 E2工作液配制 称取5.00mg E2，加入1L超纯水于磁力搅拌器上连续搅拌24h.采用预先灼烧4h的0.45μm GF/F过滤，滤液使用高效液相定量后作为母液避光保存于4℃下.

1.2.3 腐殖酸理化特性表征 元素分析 分别称取（2.00±0.02）mg的HA、FA和SAHA于无盖长方体锡箔盒中并压扁，将包好的样品放入元素分析仪（Elementar Vario MICRO cube，德国）进样口，采用CHNS模式对每个样品重复测定2次，O含量通过差减各元素的平均含量获得.元素含量测定条件为燃烧炉温度1150℃，还原炉温度850℃，载气氧和氦分别为0.25MPa和0.2MPa.

固相CP/MAS13C NMR分析 分别称取60.00mg 3种腐殖酸于核磁管中，使用固相交叉极化结合魔角旋转13C核磁共振技术在核磁共振仪（Bruker AV-300，瑞士）上进行13C谱测定.测定观察频率为75.48MHz，谱宽为26.46KZ，循环延迟时间为5s.谱图的化学位移采用外标甘氨酸校正.

UV-Vis分析 用移液器分别移取一定量的3种腐殖酸母液于40mL试剂瓶中，向其中加入超纯水以配制成溶解性有机碳浓度为5.00mgC/L的溶液.用1.0mol/L的NaOH将溶液pH值调节为7.8，于紫外-可见光谱仪（SHIMADZU UV-2600，日本）上分别测定3种腐殖酸的吸收特征光谱.测试扫描范围为200～700nm，波长间距为0.5nm.

1.2.4 腐殖酸对E2光降解的影响 配制40mL含5.00mgC/L 3种腐殖酸的E2溶液，调节溶液pH值为7.8±0.2，平衡2h后再次调pH值，装入50mL石英管于如图2所示的模拟太阳光化学反应仪（λ＞290nm）和自然太阳光照射下进行E2光降解实验.实验温度控制为（25±0.5）℃，并保持与空气接触.在同样的实验条件下，考察不同来源和浓度的腐殖酸对E2光降解的影响.

图2 光化学降解实验装置Fig.2 Experimental setup of photodegradation

1.2.5 E2定量分析 采用Agilent Technologies 1260高效液相色谱对E2进行定量分析.测定条件为:Waters C18反相柱（4.6mm×250mm，5μm），荧光检测器（Ex/Em=283/346），流动相为60%的乙腈（含0.1%三氟乙酸），等度洗脱，流速为1mL/min.

2 结果与讨论

2.1 腐殖酸结构特性表征

2.1.1 元素分析 元素分析可为腐殖酸的来源和结构提供基础信息，HA、FA和SAHA的灰分、各元素含量、H/C和O/C值等分析结果如表1所示.结果显示，3种腐殖酸均由C、O、H、N及少量的S组成，灰分含量均低于1.0%.HA、FA和SAHA的碳含量分别为56.07%、43.99%和54.42%，H/C值均小于2.0，这便确定了从滇池底泥所提取的HA和FA确实为腐殖物质［20］，H/C值与灰分含量共同确定了腐殖酸提取实验操作的可靠性.尽管不同来源腐殖酸的组成元素种类相似，但各元素含量差异较大.与SAHA相比，HA含较多的C、H、N元素，而SAHA含有更多的O和S元素，这与其来源和形成过程相关［21］.HA和FA的元素组成与大多数研究者所报道的含量相似［22］，但二者均含较多的S元素.与HA相比，FA的腐殖化程度较低，其含较多的O元素和较少的C元素.

H/C值可指示腐殖酸的来源及腐殖酸的芳香结构和脂肪结构含量［23］.元素分析结果显示，HA和FA的H/C值均较SAHA的大，表明HA和FA含有更多的脂肪结构，而SAHA含有更多的芳香结构.FA的H/C值明显比HA的H/C值大，因此FA比HA含更少的芳香结构.O/C值常被作为腐殖酸中羧基等含氧官能团含量的指标［24］.3种腐殖酸O/C值大小顺序为FA＞SAHA＞HA，滇池底泥FA的O/C值与太湖竺山湖区的表层沉积物中FA的O/C值（0.693）相近，而比IHSS FA的O/C值（0.603）大［25］，表明滇池底泥FA含较多的羧基、羟基、烷氧基等含氧基团.另外，Kang等［26］指出（N+O）/C值可以反映腐殖酸的极性大小，其值越大，极性越强，水溶性也越大.3种腐殖酸的极性和水溶性大小顺序为FA＞SAHA＞HA，与Pan等［27］研究结果相似.（N+O）/C值所指示的极性顺序与O/C值大小顺序相同，因此推测滇池底泥中HA和FA的极性主要由含氧官能团决定.

表1 HA、FA和SAHA元素分析结果Table 1 The element analyzing of extracted HA， FA and SAHA

2.1.2 固相CP/MAS13C-NMR分析 NMR碳谱测试中各类型碳在相应的化学位移处均有清晰的响应，测试结果如表2所示.

表2 HA、FA和SAHA的不同碳官能团组成（%）Table 2 Carbon-containing functional group composition of HA， FA and SAHA （%）

从表2可以看出，脂肪碳［（0～50）×10-6］，烷氧基碳［（50～108）×10-6］和芳香碳［（108～145）×10-6］是HA、FA和SAHA的3个主要特征峰带，3种碳均在总碳含量中占了相当大的比重，此结果与Wang等［28］对土壤腐殖酸进行的核磁表征结果相似.3种腐殖酸均表现为脂肪碳与烷氧基碳含量之和大于其芳香碳含量，且芳香碳主要由与氢原子相连的碳［（108～145）×10-6］和与氧原子相连的碳［（145～162）×10-6］组成.与元素分析H/C值大小顺序相一致，HA的脂肪度和芳香度都与FA的相差不大，而SAHA的芳香度明显高于HA和FA的芳香度.与IHSS FA不同的是滇池底泥FA没有明显的甲氧基峰［（45～60）×10-6］，但此与太湖竺山湖区表层沉积物中FA的碳谱信息相似［24］，这与湖泊中DOM的形成过程相关.在羧基碳［（162～190）×10-6］和羰基碳［（190～230）×10-6］的化学位移区域内，3种腐殖酸均表现出强的羧基碳峰和弱的羰基碳峰，但不同来源腐殖酸的羧基碳和羰基碳含量不同.表2中HA、FA和SAHA的脂肪度、芳香度及3种腐殖酸的极性指数参考Kile等［29］所报道的处理方式及式（1）～式（3）计算，其值分别为0.32、0.42和0.33，其也与元素分析中（N+O）/C所指示的极性大小顺序相一致.

2.1.3 UV-Vis分析 腐殖酸的紫外吸收特性曲线、吸光度比值以及单位浓度吸光系数等对其来源和结构具有明显的指示作用［30］.HA、FA和SAHA的UV-Vis光谱及320～680nm波长范围内单位浓度下的吸光系数如图3所示.其中单位浓度吸光系数α由式（4）计算获得［30］，并采用指数模型［式（5）］对其进行拟合.

式中:α为波长λ下单位浓度腐殖酸的吸光度，L/（mgC·m）；C0为腐殖酸浓度，mgC/L；l为吸光度测定池光程（常为0.01m）；A、B和k均为常数.

图3 HA、FA和SAHA的紫外-可见吸收特性Fig. 3 Ultraviolet-visible light absorption characteristics of HA， FA and SAHA

HA、FA与SAHA具有相似的紫外-可见吸收光谱特征，在280nm附近都有强烈的芳香结构吸收峰，单位浓度腐殖酸的吸光系数均随波长增加而呈指数模型减小（图3），该结果与于春艳等［31］对腐殖酸影响2，4-D光降解的研究结果相似.3种腐殖酸在320～680nm范围内均表现出宽而钝的吸收峰，这可能是腐殖酸中所包含的大量官能团的吸收峰相互叠加的结果.240～380nm吸收光谱带通常称为电子迁移带，其吸收强度主要受芳香环上极性官能团如羟基、羰基和羧基等的影响，且吸收强度随官能团含量的增加而增强［32］.因此，由图3可知，3种腐殖酸均含有大量的极性官能团.从而证实了腐殖酸所表现出的宽而钝的吸收特征确实是大量官能团的吸收峰相互叠加所致.与FA和SAHA不同的是，HA在380～420nm具有吸收平台，这与HA中的缔合芳香结构相关［33］.

为了获得3种腐殖酸来源和芳香度等更为详细的信息，按式（6）、（7）和（8）分别对3种腐殖酸的E4/E6值、SUVA254和色调系数△lgk进行了计算，其结果如表3所示.

式中:A465、A665、A254、A400和A600为各腐殖酸在波长465、665、254、400和600nm处的吸光度；［DOC］为以溶解性有机碳计的各腐殖酸浓度.

表3 HA、FA和SAHA的紫外-可见特征吸收值Table 3 The ultraviolet-visible light absorption eigenvalues of HA， FA and SAHA

与HA和FA相比，SAHA具有较大的SUVA254值，因此SAHA的腐殖化程度较高，外源性DOM含量较多［34］.这是由于SAHA主要为陆源溶解性有机质，富含木质素和芳香组分，含有极少的营养元素，而HA和FA以内生溶解性有机质为主，富含脂肪组分和营养元素，其形成过程与微生物活动密切相关.窦森等［35］指出，△lgk与不饱和程度呈正比，与氧化度和芳香度呈反比.因此，本研究中的3种腐殖酸的氧化度和芳香度的大小顺序为SAHA＞HA＞FA，不饱和度与此顺序相反.根据腐殖酸的表观分子量和芳香缩合程度与E4/E6值呈负相关关系［36］，可以判定HA、FA和SAHA的分子量大小和芳香缩合程度高低顺序为HA＞SAHA＞FA，这可能与HA富含缔合芳香结构相关.

2.2 腐殖酸介导E2光降解

图4 黑暗环境，自然太阳光和模拟太阳光下5mgC/L溶解性有机质对E2的光解的影响Fig. 4 Effects of 5mgC/L dissolved organic matter on E2 photodegradation under black condition， solar and simulated irradiation

2.2.1 腐殖酸对E2光降解的促进作用 图4b和4c分别为自然太阳光和模拟日光照射下5mgC/L 3种腐殖酸对E2光降解过程的影响结果，模拟光照下E2的降解过程与自然光下E2的降解过程相似，均符合准一级动力学过程.同时，光源差异所导致的E2光降解速率差异甚微，因此实验所采用模拟日光下E2的光化学行为能较好地反映自然太阳光下E2的光化学行为.

由图4a可知，黑暗条件下3种腐殖酸对E2的降解都没有贡献，且E2的直接光降解过程非常缓慢（0.0071h-1），但在HA、FA和SAHA的作用下，E2均能迅速地发生光化学降解.与柱孢藻毒素［6］、百菌清［7］等有机污染物在腐殖酸作用下的光化学降解行为相似，E2的光化学降解过程也主要是间接光降解并受到腐殖酸光化学过程的影响.与HA相比（0.0597h-1）， FA（0.1178h-1）和SAHA（0.2048h-1）更能促进E2发生光化学降解，这与FA和SAHA的含氧官能团［如-OHph、-C（O）-等］含量和分子极性大小相关.腐殖酸介导作用下E2的光降解量并不与TOC变化量成比例，而是呈现出TOC减少速率小于E2光降解速率的趋势.因此，间接光降解过程中E2并未被完全矿化，而是生成了一些稳定的中间产物.

2.2.2 腐殖酸浓度对E2光降解的影响 模拟太阳光下不同浓度的3种腐殖酸对E2光降解的影响结果如图5所示，腐殖酸对E2光降解过程的作用与自身浓度大小密切相关.与低浓度（10mgC/L）腐殖酸反应体系相比，高浓度（20mgC/L）的3种腐殖酸均会对E2光降解过程产生明显的抑制作用.这是由于低浓度腐殖酸在光化学过程中的滤光作用较弱［37］且产生的活性氧（ROS）大量作用于E2，从而表现出对E2光降解具有促进作用.然而，高浓度的腐殖酸能过滤绝大部分入射光并大量淬灭产生的ROS［38］，从而对E2光降解过程表现出抑制效应.高浓度的3种腐殖酸抑制E2光降解的能力大小顺序为SAHA＞HA＞FA，此顺序与3种腐殖酸的芳香度大小一致.因此，腐殖酸的芳香结构可能是除含氧官能团之外影响E2光降解过程的又一主要结构.

图5 不同浓度腐殖酸对E2光解的影响Fig. 5 Effects of different humic acids concentration on the E2photodegradation

2.2.3 腐殖酸产生的主要ROS鉴定 向反应体系加入能特定性地与某种ROS快速反应的探针分子，使其与E2竞争性地同特定种类的ROS反应从而降低E2的光降解速率，因此通过E2光化学降解速率的变化可定性地判断出反应体系在光化学过程中产生的ROS［39］.羟基自由基（HO·）是一种活性非常高且普遍存在于环境中的ROS，异丙醇（IPA）可以有效地清除反应体系中的HO·［kHO·，IPA=1.9×109L/（mol·s）］［40］.向含5mgC/L的腐殖酸E2溶液中加入2mmol/L IPA，平衡1h后于模拟太阳光下进行光降解实验.结果显示，加入IPA体系中的E2光降解受到了明显地抑制（图5），与未加入羟基捕捉剂的反应体系相比，加入IPA溶液中E2的光降解动力学常数减小了近70%.因此，HO·在E2间接光降解过程中确实起到积极作用.图6和式（9）～式（20）概括了反应体系中腐殖酸产生HO·所发生的一系列光化学过程.根据HO·在含腐殖酸体系中存在的确定性和腐殖酸的光化学过程可以推断，在受光照的腐殖酸溶液中还存在其他种类的ROS，如3HS*、1O2、和等.但这些ROS对E2光降解过程的促进效力不如·OH.

图6 腐殖酸的光化学过程Fig.6 Photochemical processes of humic acid

3 结论

3.1 HA和FA为内源性腐殖质，含有较多的营养元素N，其形成与微生物活动密切相关.元素分析显示，HA、FA和SAHA的（N+O）/C值分别为0.50、0.82和0.55，3种腐殖酸的极性大小顺序为FA＞SAHA＞HA.核磁共振13C谱分析显示，3种腐殖酸的极性指数分别为0.32、0.42和0.33，与元素分析结果一致.脂肪和芳香组分在3种腐殖酸的组成中都占了相当大的比重，且3种腐殖酸的脂肪碳含量均比芳香碳含量高.

3.2 3种腐殖酸具有相似的紫外-可见吸收特征，320～680nm范围内均表现出宽而钝吸收峰.紫外-可见吸收特征分析显示，3种腐殖酸的分子量和芳香缩合程度顺序为HA＞SAHA＞FA.

3.3 E2在纯水中的光降解速率为0.0071h-1，5mgC/L浓度的HA、FA和SAHA均能促进E2发生服从准一级动力学规律的光化学降解，速率常数分别为0.0597、0.1178和0.2048h-1.与低浓度腐殖酸相比，高浓度的3种腐殖酸溶液均对E2的光降解过程具有抑制作用.

3.4 HO·是腐殖酸-E2体系中导致E2发生降解的主要ROS，由HO·引起的E2光降解量占到了E2降解总量的70%左右.

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Structural characteristics of DOM and its effects on the photodegradation of 17β-estradiol.

REN Dong， YANG Xiao-xia， MA Xiao-dong， GU Li-peng， HUANG Bin*， PAN Xue-jun （Faculty of Environmental Science and Engineering，Kunming University of Science and Technology， Kunming 650500， China）. China Environmental Science， 2015，35（5）：1375～1383

Elemental analysis， UV-vis spectroscopy and13C nuclear magnetic resonance were used to characterize the humic acid （HA） and fulvic acid （FA）， which were extracted from the sediments， collected from Dianchi Lake， by the methods recommended by International Humic Substance Society （IHSS）. Optical and structural characteristics of the two dissolved organic matter （DOM） were compared with that of the humic acid purchased from Sigma Aldrich （SAHA）， and their effects on the 17β-estradiol （E2） photodegradation were also studied. It was found that HA and FA has similar element composition with SAHA， and the value of （N+O）/C was 0.50， 0.82 and 0.55 for HA， FA and SAHA， respectively. The polarity index analyzed by13C NMR was 0.32 for HA， 0.42 for FA and 0.33 for SAHA， which was consistent with the result of elemental analysis. HA and FA are endogenous DOM with higher nitrogen content and associative aromatic cycles than SAHA， whereas the SAHA is an extrinsic DOM with higher aromaticity. HA， FA and SAHA all can promote the photodegradation of E2 when compared with that in ultrapure water （k = 0.0071h-1）. The rate constant is 0.0597，0.1178 and 0.2048h-1when mediated by 5mgC/L HA， FA and SAHA， respectively. The HO·， contributing approximate 70% to the photodegradation of E2， is an important reactive oxygen species （ROS） produced by the irradiated humic substances. The promoting ability of the three humic substances is controlled by the oxygen-containing functions and aromatic structures. These humic substances， at lower concentration， can significantly promote the photodegradation of E2，whereas the higher concentration DOM could inhibit the photodegradation of E2 by quenching the ROS and filtering the incident light.

humic acid；fulvic acid；structural characteristics；17β-estradiol；reactive oxygen species （ROS）；photodegradation

X132

A

1000-6923（2015）05-1375-09

任 东（1987-），男，四川苍溪人，昆明理工大学博士研究生，主要从事天然有机质与内分泌干扰物间相互作用和内分泌干扰物环境行为方面研究.

2014-09-20

国家自然科学基金（41401558）；中国博士后科学基金（2014T70887，2013M531987）；云南省应用基础研究计划项目（2012FB124）；云南省教育厅科学研究基金项目（2014J022）；中国科学院环境化学与生态毒理学国家重点实验室开放基金（KF2013-04）

* 责任作者， 副教授， huangbin@kmust.edu.cn