肺癌组织中转录因子E2F-1的表达及意义

戴彭辰，何成诗，刘一诚，王超群，李慧英

（1成都中医药大学，2成都中医药大学附属医院，四川成都610075）

·基础与转化医学·

肺癌组织中转录因子E2F-1的表达及意义

戴彭辰1，何成诗2，刘一诚1，王超群1，李慧英1

（1成都中医药大学，2成都中医药大学附属医院，四川成都610075）

目的：探究肺癌组织中转录因子E2F-1的表达及意义.方法：选取62例肺癌组织作为观察组，10例正常组织作为对照组，采用免疫组化方法检测各组织中E2F-1的表达情况.结果：E2F-1在观察组中的阳性表达率为67.74％，高于对照组的10.00％，差异具有统计学意义（P＜0.05），且E2F-1的表达随着肿瘤分期的升高而增高，差异具有统计学意义（P＜0.05）.结论：肺癌组织中E2F-1的高表达可作为肿瘤浸润程度的标记物，对肺癌的发生发展起着重要作用.

E2F-1；肺癌；免疫组织化学

0 引言

肺癌是常见的恶性肿瘤，是目前发病率和死亡率增长最快，对人民群众健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，其中男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位［1］.肺癌的病因至今尚不完全明确，转录因子E2F-1是由人类E2F-1基因编码出的蛋白质，该蛋白质是E2F转录因子家族中的成员.E2F家族在控制细胞周期及抑癌基因功能上起到重要作用，也是小DNA致癌病毒转化蛋白的靶点.研究表明，肿瘤的发生与转录因子E2F-1的异常调控有着密切联系［2-3］，但目前在肺癌发病机制的研究中对E2F-1的作用了解较少.本研究采用免疫组化法，检测肺癌组织及正常组织中E2F-1的表达，探讨其临床表达意义，现报道如下.

1 材料和方法

1.1组织材料 收集保存的62例肺癌组织石蜡包埋标本，其中男32例，女30例，年龄27～69（平均55.1±3.4）岁.其中，标本显示腺癌20例、鳞癌28例、未分化癌14例.另选取10例癌旁正常肺组织作为对照组.两组材料的一般情况比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性.

1.2免疫组化方法 采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法：①石蜡切片，常规脱蜡至水.②3％H2O2去离子水（无色液体）孵育10～30 min，以灭活内源性过氧化物酶活性.③蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min.④候选步骤：采用抗原修复：微波（建议30 min内4次中火）、高压、酶修复方法.⑤血清封闭：室温15～30 min.⑥滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育2～3 h或4℃过夜.PBS冲洗，3 min×5次.⑦滴加生物素标记的二抗，室温或37℃孵育30 min～1 h.⑧PBS冲洗，3 min×5次.⑨滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或37℃孵育30 min～1 h.⑩PBS冲洗，3min×5次.〇11 DAB显色剂显色.〇12自来水充分冲洗.〇13可进行复染，脱水、透明.〇14选择适当的封片剂封片.E2F-1（1B100，抗原修复）为鼠抗单克隆抗体，上海胜隆公司产品，PBS替代一抗阴性对照.

1.3结果判断 E2F-1染色后，根据染色范围及染色程度进行综合判断，分为阴性（-）和阳性（+）2个等级.阳性表达的标志：细胞核及胞质中呈现黄褐色或黄色颗粒样变（图1、图2）.

图1　免疫组化SP法染色，细胞质阳性表达

图2　免疫组化SP法染色，细胞核阳性表达

1.4统计学处理 采用SPSS19.0统计学软件对数据进行分析，计数资料用％表示，行χ2检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义.

2 结果

E2F-1在对照组中的阳性表达率为10.00％（1/ 10），而在肺癌组织中的阳性表达率为67.74％（42/ 62），E2F-1在肺癌组织中的阳性表达率高于对照组. E2F-1在肺癌组织中的表达与肿瘤发生发展的病理特征存在密切联系.统计显示，肿瘤的分期越晚，E2F-1的阳性表达率越高，其中T1期表达最低，T2期及T3期表达越高，且不同分期之间的差异有统计学意义（P＜0.05）；E2F-1在淋巴结转移患者体内也出现了比无转移者的高表达率，但两者对比，差异无统计学意义（P＞0.05）；E2F-1的表达在病理结果显示，其在鳞癌、腺癌、未分化癌中阳性表达率依次增高，结果具有统计学意义（P＜0.05，表1）.

表1　肺癌E2F-1表达与病理特征关系（％）

3 讨论

E2F是1986年发现的细胞周期调控因子，它作为转录因子在cyclin-cdk-Rb通道中被激活.目前研究［4-6］显示，E2F家族中的多个成员蛋白包含许多进化保守的结构域，这些结构域包括：DNA结合域、与受分化调控的转录因子蛋白（DP）之间相互作用的二聚化结构域、富含酸性氨基酸的转活化结构域以及位于转活化结构域中的抑癌蛋白关联结构域.该蛋白与其他两个成员E2F-2及E2F-3具有额外的周期蛋白结合结构域，E2F-1以细胞周期依赖性的模式优先与视网膜母细胞瘤蛋白pRB结合，并可以同时介导细胞增殖及p53-依赖/非依赖的细胞凋亡.

E2F异二聚体结合pRb时，E2F的转录激活就会被抑制.E2F的释放一般发生在G1中后期，并影响G1PS期所需的蛋白表达及DNA合成，pRb去磷酸化同时被cy-clin EPcdk2和cyclin DPcdk4P6所催化，从而影响细胞的周期运行，因此E2F被认为是能够调控细胞增殖并影响细胞周期的重要转录因子［7-8］.研究［9］还显示，E2F的异常高表达与一些肿瘤的形成和发展存在密切联系，并在一定程度上能够引起细胞的过度增殖和恶性转化.

相关研究［10］指出，E2F-1是E2F蛋白家族中最先被克隆的转录因子，其特性也是整个E2F家族中最先被了解的.研究［11］还指出，E2F-1在肿瘤的发生中起到了重要作用.在多种癌症中，均发现了高表达的E2F-1，这表明转录因子E2F-1在机体内起到促癌基因的效果，对肿瘤的发生发展起着关键作用.Ray等［12］在Rb1（+P-）鼠的实验研究中指出，去除E2F-1的表达后，小鼠的甲状腺肿瘤及垂体肿瘤的发生率显著降低.体外细胞培养实验［13］证实，成纤维细胞的恶性变与E2F-1的高表达有关.但也有研究［14］指出，E2F-1作为转录因子起抑癌作用，出现促癌的原因可能与实验方法或者组织、细胞类型不同有关.有研究发现，E2F-1在结肠癌转移到肺组织中表达水平明显高于结肠癌转移到肝组织的表达水平［15］.在恶性支气管上皮细胞株的培育中，恶性支气管上皮细胞株中E2F-1表达高于正常细胞株［16］.而E2F-1是否在原发性肺癌组织中高表达的研究报道却很少见.

本研究结果显示，E2F-1在肺癌组织中表达比正常的肺组织显著增高，说明在细胞周期中，E2F-1的高表达能促进细胞增殖、缩短细胞周期，对肺癌的发生发展有促进作用.也有专家［17］指出，E2F-1的激活引起下游抑癌基因p73发生突变，进而引起细胞凋亡障碍，这是导致肺癌发生的原因之一.另外，本研究还发现，肺癌病理类型的不同也与E2F-1的表达有关，鳞癌中E2F-1的阳性表达率为55.00％，腺癌中的阳性表达率达到了67.86％，而在未分化癌中其阳性表达率高达80.00％，这说明E2F-1在肺癌、腺癌及未分化癌中具有高表达率，提示可以在以后的基因靶向治疗中成为一个突破口.研究发现，转录因子E2F-1的高表达还跟肿瘤的生物学行为存在关系.谢庆祥等［10］研究指出，E2F-1的表达高低和膀胱癌的分级及分期有密切联系.研究［18］还发现，E2F-1的高表达直接影响乳腺癌的预后，高表达的E2F-1基因在头颈部癌细胞的转录后，肿瘤浸润性显著增强.

本研究还发现，E2F-1的阳性表达率随着肿瘤分期的提高而增高，表明E2F-1的阳性表达与肿瘤分期存在显著相关性.研究结果还显示，E2F-1的阳性表达与淋巴结转移存在一定联系，但统计学意义不显著，这表明E2F-1在肿瘤的淋巴结转移中不能作为标记物，也有可能与本次实验的方法及材料有关.

［1］Pickering MT，Stadler BM，Kowalik TF.miR-17 and miR-20a temper an E2F1-induced G1 checkpoint to regulate cell cycle progression［J］.Oncogene，2009，28（1）：140-145.

［2］Ladu S，Calvisi DF，Conner EA，et al.E2F1 inhibits c-Myc-driven apoptosis via PIK3CA/Akt/mTOR and COX-2 in a mouse model of human liver cancer［J］.Gastroenterology，2008，135（4）：1322-1332.

［3］Johnson DG，Schwarz JK，CressWD，et al.Expression of transcription factor E2F1 induces quiescent cells to enter S phase［J］. Nature，1993，365（6444）：349-352.

［4］Knoll S，Emmrich S，Pützer BM.The E2F1-miRNA cancer progression network［J］.Adv Exp Med Biol，2013，774：135-147.

［5］van Oosterwijk JG，Herpers B，Meijer D，etal.Restoration of chemosensitivity for doxorubicin and cisplatin in chondrosarcoma in vitro：BCL-2 family members cause chemoresistance［J］.Ann Oncol，2012，23（6）：1617-1626.

［6］Xie Y，Yin Y，Li L，et al.Short interfering RNA directed against the E2F-1 gene suppressing gastric cancer progression in vitro［J］. Oncol Rep，2009，21（5）：1345-1353.

［7］Yamasaki L，Bronson R，Williams BO，etal.Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of RbI（+/-）mice［J］. Nat Genet，1998，18（4）：360-364.

［8］Hong X，Yang ZY，Wang M，et al.Multidrug resistance-associated protein 3 and Bcl-2 contribute tomultidrug resistance by vinorelbine in lung adenocarcinoma［J］.Int JMol Med，2011，28（6）：953-960.

［9］Rajagopala SV，Sikorski P，Caufield JH，et al.Studying protein complexes by the yeast two-hybrid system［J］.Methods，2012，58（4）：392-399.

［10］谢庆祥，张闽峰，林福地，等.膀胱癌中转录因子E2F的表达及其临床意义［J］.诊断病理学杂志，2002，9（2）：102-103.

［11］冯丽艳，杨生永，安国顺，等.E2F-1介导8-氯-腺苷引起的人肺癌细胞H1299的凋亡［J］.中国生物化学与分子生物学报，2008，24（9）：861-865.

［12］Ray RM，Bhattacharya S，Johnson LR.Mdm2 inhibition induces apoptosis in p53 deficient human colon cancer cells by activating p73-and E2F1-mediated expression of PUMA and Siva-1［J］.Apoptosis，2011，16（1）：35-44.

［13］Mei Y，Wu M.Multifaceted functionsof Siva-1：more than an Indian God of Destruction［J］.Protein Cell，2012，3（2）：117-122.

［14］Yu B，Sun X，Shen HY，et al.Expression of the apoptosis-related genes BCL-2 and BAD in human breast carcinoma and their associated relationship with chemosensitivity［J］.J Exp Clin Cancer Res，2010，29：107.

［15］王晓通，李 雷，肖 强，等.E2F-1过表达对胃癌细胞生物学行为的影响［J］.广东医学，2009，30（11）：1600-1603.

［16］Hallstrom TC，Mori S，Nevins JR.An E2F1-dependent gene expression program that determines the balance between proliferation and cell death［J］.Cancer Cell，2008，13（1）：11-22.

［17］肖 强，徐君毅，谢玉波.E2F-1在胃癌组织中的突变表达及其意义［J］.中国肿瘤临床，2007，34（4）：238-239.

［18］Yang SZ，Lin FT，Lin WC.MCPH1/BRIT1 cooperateswith E2F1 in the activation of checkpoint，DNA repair and apoptosis［J］.EMBO Rep，2008，9（9）：907-915.

Expression and significance of transcription factor E2F-1 in lung cancer tissues

DAIPeng-Chen1，HE Cheng-Shi2，LIU Yi-Cheng1，WANG Chao-Qun1，LIHui-Ying11Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，2Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610075，China

AIM：To investigate the expression and significance of transcription factor E2F-1 in the pathogenesis of lung cancer. METHODS：A total of 62 cases of lung cancer were selected as the observation group and 10 cases of normal tissue as the control group.The expression of E2F-1 was detected by immunohistochemicalmethod.RESULTS：The rate of positive expression of E2F-1 in observation group was 67.74％，which was higher than 10.00％in the control group，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.The expression of E2F-1 increased with tumor staging increasing，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.CONCLUSION：The high expression of E2F-1 can be used as amarker of tumor invasion in lung cancer tissues，which plays an important role in the development of lung cancer.

E2F-1；lung cancer；immunohistochemistry

R734.2

A

2095-6894（2015）12-01-03

2015-10-27；接受日期：2015-11-13

戴彭辰.博士，主治医师.研究方向：肺癌.

E-mail：hzdpc1977@163.com

何成诗.硕士，主任医师，教授.研究方向：呼吸内科.

E-mail：18980880131@126.com