莲子低聚糖提取工艺优化及其组分分析

卢旭 张帅 林姗 吴小婷 张怡 郑宝东

摘 要 采用响应面分析法对莲子低聚糖热水浸提工艺参数进行优化，探讨浸提时间（min）、浸提温度（℃）和水料比（V/W）对热水浸提莲子低聚糖得率的影响，建立提取莲子低聚糖的二次项数学模型并验证其可靠性，得到最优提取工艺参数，并采用高效液相色谱法对莲子低聚糖组分进行初步分析。结果表明：热水浸提莲子低聚糖的最佳提取工艺条件是浸提时间为66 min，浸提温度为81 ℃，水料比为80 ∶ 1，在此工艺条件下莲子低聚糖得率为8.09%。影响低聚糖提取工艺的主次因素顺序为：水料比>浸提温度>浸提时间。高效液相色谱法测定莲子低聚糖，发现莲子低聚糖由四聚糖、三聚糖和二聚糖组成。

关键词 莲子；低聚糖；提取工艺；响应面法；高效液相色谱

中图分类号 R282.71 文献标识码 A

莲子是中国重要的出口创汇特色农副产品之一，除福建、江西两省为主要产区外，在浙江、湖南、江苏、湖北、河北、台湾等省亦均有商业栽培。莲子为药食两用食品，除含有丰富的淀粉、蛋白质、生物碱和类黄酮外，还含有超氧化物歧化酶、低聚糖、多糖等功效成分[1-2]。目前，低聚糖已被证实为有效的双歧杆菌增殖因子之一[3-5]，摄入低聚糖可调节肠道菌群，从而起到增强机体免疫、降血脂、降血压等功能[6]。低聚糖的聚合度对益生菌利用率具有重要的影响，其吸收能力一般隨分子量的减小而增大，同时对抗致病菌能力也有一定的影响，聚合度越低的低聚糖抗菌活性越强[7-9]。吴小南等[10]将发酵莲子乳灌胃小鼠，结果发现灌胃后的小鼠结肠运动加快，肠内粪便滞留时间减少，推测可能与发酵莲子乳中含有大量的棉子糖类似物有关。

低聚糖获取方式主要包括化学合成法和以动植物为原料来源的溶剂提取法[11]、酶解法[12]、生物法[13-14]等。响应面设计法（Response Surface Method，RSM）能够克服传统数理统计方法处理数据量大、不能分析因素之间交互影响和精度不高的缺点，随着计算机应用技术的发展，此法已广泛应用于食品工业中的加工提取工艺及工艺配方设计的优化[15]。

本研究以速冻鲜莲为供试原料，研究浸提时间、浸提温度和水料比等单因素对热水浸提低聚糖得率的影响。采用苯酚-硫酸法测定低聚糖含量，使用中心组合设计响应面分析法优化莲子低聚糖热水浸提工艺参数。同时通过高效液相色谱法对莲子低聚糖的小分子糖类成分及各组分聚合度进行测定，为充分开发利用莲子低聚糖资源及工业化应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂 速冻鲜莲：由绿田（福建）食品有限公司提供；95%乙醇，购自国药集团化学试剂有限公司；蔗糖和棉籽糖：购自美国sigma公司；水苏糖：购自阿拉丁试剂（上海）有限公司。

1.1.2 仪器设备 FW177中草药粉碎机：购自天津泰斯特仪器有限公司；DHG-9053A电热鼓风干燥箱：购自上海一恒科学仪器有限公司；SH-Ⅱ循环水式多用真空泵：购自郑州长城科工贸有限公司；RE-5298A旋转蒸发仪：购自上海亚荣生化仪器厂；HH-4数显恒温水浴锅：购自国华电器有限公司；FD-4C-80冷冻干燥机：购自北京博医康实验仪器有限公司；LC-20A高效液相色谱仪：购自日本岛津。

1.2 方法

1.2.1 莲子低聚糖提取工艺流程 速冻鲜莲取出后解冻1 h，筛选去芯后放入鼓风干燥箱50 ℃烘干至恒重。干燥后的莲子粉碎过100目筛，按一定水料比加入去离子水，以一定温度加冷凝管回流提取一定时间后过滤，弃滤渣。滤液经真空浓缩后加入3倍体积95%乙醇，于4 ℃静置隔夜，离心得上清液。

1.2.2 单因素实验 分别考察浸提时间、浸提温度及水料比对莲子低聚糖得率的影响，以苯酚-硫酸法[16]计算莲子低聚糖得率。苯酚-硫酸法以葡萄糖作为标定物换算低聚糖的浓度，标准曲线为Y=0.007 2 X-0.003 3（R2=0.998 4），式中：Y为溶液在490 nm波长处的吸光度值；X为溶液中葡萄糖浓度（μg/mL）。

莲子低聚糖得率=×100% （1）

式中：C为测定溶液中莲子低聚糖浓度（mg/mL），V为测定溶液体积（mL），n为溶液稀释倍数，m为莲子干重质量（mg）。

1.2.3 响应面优化试验 参考单因素试验结果和试验误差控制，选择浸提时间、浸提温度及水料比3个因素进行3因素3水平优化试验。采用中心组合设计（Central Composite Design），利用响应面法对提取条件进行优化。以莲子低聚糖得率（Y/%）为考察指标，以浸提时间（A）、浸提温度（B）及水料比（C）为自变量，因素水平编码见表1。

1.2.4 验证试验 根据所建立的二次项数学模型预测莲子低聚糖在最佳提取工艺参数下的得率，相同条件下测定莲子低聚糖的实际得率，以验证响应面预测的准确性。

1.2.5 莲子低聚糖组分分析 采用高效液相色谱法对莲子低聚糖组分进行初步分析。取1.2.1步骤所产生的莲子低聚糖粉末，加去离子水定容至100 mL，取待测溶液1 mL经0.22 μm微孔膜过滤后注入高效液相色谱分析。

色谱条件为上样量：20 μL；色谱柱：安捷伦Hi-plex Na（Octo）柱（300 mm×7.7 mm，8 μm）；流动相：蒸馏水；检测器：RID-10A示差检测器；流速：0.6 mL/min；柱温：85 ℃。

1.3 数据分析

采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面优化设计。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 浸提时间对莲子低聚糖得率的影响 由图1可知，当浸提温度为70 ℃，水料比为40 ∶ 1时，莲子低聚糖的得率随着浸提时间的延长出现先增后降的趋势。当浸提时间为60 min时，莲子低聚糖的得率达到峰值。浸提时间太长可能导致部分莲子糖类物质与游离氨基酸发生美拉德反应，使得溶液色泽加深，低聚糖得率降低[17]。由此确定最佳浸提时间为60 min。

3 讨论与结论

多数植物的根茎、果实和种子均含有丰富的低聚糖，目前提取天然植物低聚糖的对象主要有大豆、火龙果、麦麸、大蒜、藻类、地黄等植物。本实验通过响应面法优化热水浸提莲子低聚糖工艺并对各影响因素间的相互作用进行研究，得到莲子低聚糖得率影响因素的主次顺序依次为：水料比>浸提温度>浸提时间，各因素之间无交互作用。莲子低聚糖提取最佳工艺条件：浸提时间为66 min，浸提温度为81 ℃，水料比为80 ∶ 1；实际测得低聚糖得率为8.09%，与理论预测值8.08%基本一致，与山药（7.21%）[22]、雪莲果（6.32%）[23]和肉苁蓉（3.72%）[24]等原料相比提取得率较高，说明莲子中低聚糖含量较高。已有研究结果表明，不同的提取方法对低聚糖得率有显著影响，唐雪娟[25]以超声波法辅助提取香蕉低聚糖，得率（17.89%）明显高于温水法提取香蕉低聚糖的得率。宋春丽等[26]的研究结果表明，以高温变性豆粕为原料提取大豆低聚糖，微波辅助提取微波辅法提取低聚糖的效果优于超声波法。田玉庭等[27]采用超声波法辅助提取莲子低聚糖，莲子低聚糖得率为1.13%。本研究经热水浸提的莲子低聚糖得率高于超声波辅助提取法，可能与前者提取过程中所采用的脱蛋白、酵母发酵等中间步骤过多有关，造成低聚糖在提取过程中大量损失，导致最终得率降低。

上述低聚糖提取研究中，并未对低聚糖组成成分做出具体说明。本研究高效液相色谱结果表明，莲子低聚糖含有3个组分，主要由二聚糖、三聚糖和四聚糖构成，以三聚糖和四聚糖为主，这与花生粕低聚糖和大豆低聚糖的组成成分相似[28-29]，提示莲子低聚糖可能具有良好的机体吸收利用能力，且可能具有与大豆低聚糖相似的生理活性功能。莲子低聚糖在高效液相色谱的保留时间与水苏糖、棉籽糖、蔗糖相近，为较低分子量的低聚糖；据孙丽萍等[30]报道不同分子量低聚糖的体外清除自由基的活性有差异，分子量小于1 000的褐藻胶寡糖比分子量更大的褐藻胶寡糖具有较优的清除自由基能力，推测莲子低聚糖相比聚合度较大的低聚糖，可能具有良好的生理活性。由于相同分子量的低聚糖可能还含有不同糖苷键异构体，较难通过色谱柱将其完全分离，因此莲子低聚糖各成分的具体结构和生理活性还有待于进一步深入研究。

参考文献

[1] 郑宝东. 莲子科学与工程[M]. 北京： 科学出版社， 2010.

[2] 郑宝东， 郑金贵，曾绍校. 我国主要莲子品种营养成分的分析[J]. 营养学报. 2003， 25（2）： 153-156.

[3] Gopal P K， Prasad J， Gill H S. Effects of the consumption of Bifidobacterium lactis HN019（DR10TM）and galacto-oligosaccharides on the microflora of the gastrointestinal tract in human subjects[J]. Nutrition Research， 2003， 23（10）： 1 313-1 328.

[4] Yuan X， Wang J， Yao H. Feruloyl oligosaccharides stimulate the growth of Bifidobacterium bifidum[J]. Anaerobe， 2005， 11（4）： 225-229.

[5] 盧 旭. 莲子低聚糖对双歧杆菌增殖效应的研究[D]. 福州： 福建农林大学， 2012.

[6] 王向红， 吉爽爽， 桑亚新，等. 金丝小枣低聚糖的制备及其对双歧杆菌体外促生长的研究[J]. 中国食品学报， 2012， 12（9）：28-33.

[7] 胡学智， 伍剑锋. 低聚果糖的生理功能及生产、 应用[J]. 中国食品添加剂， 2007， 6（1）： 148-157.

[8] 韦新葵， 雷朝亮. 蝇蛆几丁低聚糖抑菌作用的初步研究[J]. 中国农业科学， 2004， 37（4）： 552-557.

[9] 王 敏， 臧师竹， 辛 毅，等. 小鼠肠道对壳寡糖的吸收率及吸收成分的影响[J]. 中国微生态学杂志， 2013， 25（10）： 1 143-1 144.

[10] 吴小南， 陈 洁， 汪家梨， 等. 发酵莲子乳对小鼠胃肠道运动、吸收功能的调节作用[J]. 世界华人消化杂志， 2005， 13（21）： 2 535-2 539.

[11] 张立峰， 刘庆富，宁海凤. 从豆清水中提取大豆低聚糖的工艺研究[J]. 食品工业科技， 2013， 34（12）： 220-224.

[12] 黄汝清，欧仕益. 草酸蒸煮处理和表面活性剂对酶法制备低聚糖阿魏酸酯的影响[J]. 中国食品学报， 2012， 12（5）： 71-75.

[13] 邵 曼， 倪 辉， 蔡慧农， 等. 利用法夫酵母JMU-MVP14联产发酵虾青素和功能性低聚糖的研究[J]. 中国食品学报， 2012， 11（7）： 4-13.

[14] 王昌涛， 黄 鹏， 崔希庆. 从大豆糖蜜发酵液中提取、纯化低聚糖[J]. 中国食品学报， 2011， 11（5）： 24-31.

[15] 王永菲， 王成国. 响应面法的理论与应用[J]. 中央民族大学学报： 自然科学版， 2005， 14（3）： 236-240.

[16] 张惟杰. 糖复合物生化研究技术[M]. 杭州：浙江大学出版社，1999： 11-12.

[17] 罗存回， 贺晋艳， 曾晓雄. 鹰嘴豆α-低聚半乳糖的稳定性和美拉德反应特性[J]. 食品科学， 2011， 32（23）： 91-95.

[18] 陈 婵. 莲子多糖提取及其结构性质的研究[D]. 福州： 福建农林大学， 2007.

[19] 吴 尧， 万端极， 吴正奇，等. 微波辅助提取棉籽糖及膜纯化工艺研究[J]. 湖北工业大学学报，2014，29（1）：108-120.

[20]洪 晶，陈涛涛，唐梦茹，等. 响应面法优化韭菜籽蛋白质提取工艺[J]. 中国食品学报， 2013， 13（12）： 89-96.

[21] 曾绍校， 彭 彬， 陈 洁，等. 响应面法优化西番莲果皮花色苷提取工艺[J]. 中国食品学报， 2014， 14（1）： 104-113.

[22] 露 刘， 雁 张， 张名位，等. 响应面法优化超声波辅助提取山药低聚糖的工艺研究[J]. 广东农业科学， 2014， 41（11）：100-105.

[23] 王照波， 周文美， 徐子婷，等. 匀浆辅助水浴法提取雪莲果低聚糖的工艺研究[J]. 贵州大學学报： 自然科学版， 2009， 26（4）： 100-103.

[24] 白 英. 肉苁蓉低聚糖提取工艺的研究[J]. 食品工业科技，2006， 27（10）： 118-119.

[25] 唐雪娟， 王 淼，王 娟. 超声波法与温水法提取香蕉低聚糖的比较[J]. 广东农业科学， 2013， 40（22）： 111-114.

[26] 宋春丽， 王文侠， 曾凤彩，等. 超声波和微波辅助提取大豆低聚糖的工艺比较[J]. 食品与机械， 2011， 23（2）： 47-50.

[27] 田玉庭， 卢 旭，郑宝东. 响应面法优化莲子低聚糖超声波辅助提取工艺[J]. 北京工商大学学报： 自然科学版， 2012， 30（2）： 17-21.

[28] 韩 冰， 周 婷，李全宏. 脱脂花生粕中低聚糖的初步提取工艺研究[J]. 食品工业科技， 2011， 27（7）： 285-288.

[29] 郭 建， 王梦凡， 齐 崴，等. 响应面优化超声辅助提取大豆异黄酮联产分离蛋白和低聚糖[J]. 大豆科学， 2012， 31（4）：655-661.

[30] 孙丽萍， 薛长湖， 许家超，等. 褐藻胶寡糖体外清除自由基活性的研究[J]. 中国海洋大学学报：自然科学版， 2005， 35（5）：811-814.