琯溪蜜柚CmPME1的克隆及其在果实发育过程中的表达分析

刘志发 潘腾飞 潘东明

摘 要 利用RT-PCR技術从‘琯溪蜜柚中克隆得到1条PME（pectinmethylesterase）基因的ORF序列，命名为CmPME1。该序列编码一个含有582个氨基酸的蛋白质，分子量63.37 ku，该蛋白属于稳定的碱性亲水性蛋白。同源性分析表明：其编码的氨基酸序列与可可树（Theobroma cacao）、毛果杨（Populus trichocarpa）的同源性分别为76%、74%，与甜橙的氨基酸序列同源性高达99%。实时荧光定量PCR结果表明，随着果实的发育，CmPME1的表达量逐渐升高，在花后170 d达到最高，然后逐渐降低，远中柱汁胞CmPME1的表达量高于近中柱。

关键词 琯溪蜜柚；PME；克隆；实时荧光定量PCR

中图分类号 S813.3 文献标识码 A

琯溪蜜柚[Citrus maxima（Burm.） Merr.]果实存在汁胞粒化的生理病害， 表现为汁胞中柱和轴端汁胞异常膨大， 汁胞变硬、细胞壁加厚、木质纤维化、出汁率下降， 风味变淡。琯溪蜜柚果实汁胞粒化通常从囊瓣近蒂端汁胞发生， 后渐向果心发展， 其中以果心处长形汁胞粒化最为严重[1-3]。据观察，琯溪蜜柚果实汁胞粒化发生在果实生长后期（一般为9月中下旬开始），采后贮藏期间果实汁胞粒化进一步加重[2]。有报道指出果胶甲酯酶与柑橘果实的粒化有关[4-5]。

果胶甲酯酶（pectinmethylesterase，简称PME、PE， EC： 3. 1. 1. 11）广泛存在于植物以及一些细胞壁降解的微生物中[6]。果胶甲酯酶能水解果胶生成果胶酸、甲醇、氢离子，进而导致果胶酸钙的形成[7-9]。PME属于多基因家族，由于PME结构和表达模式的多样性，其作用也存在差异[10-11]。植物中果胶甲酯酶在细胞壁降解[12-13]，小孢子发生和花粉管发育[14-16]，种子萌发[17]，根尖延伸[18]，果实的软化成熟[19]等方面起着重要作用。近几年来，在植物中有关PME基因的克隆与表达已有许多报道，已从草莓、烟草、白菜等植物中克隆得到果胶甲酯酶基因[20-22]，认为该基因与果实衰老过程中结构变化、植物病毒之间存在相互作用、雄性不育等功能有关。此外，在柑橘汁胞和柑橘皮中也克隆得到了PME基因[23-24]。

为从探明‘琯溪蜜柚CmPME1在果实生长过程中表达水平变化与果实粒化的关系，本研究利用RT-PCR技术从‘琯溪蜜柚汁胞中克隆得到CmPME1的ORF序列，并对其进行了生物信息学分析，采用实时荧光定量PCR技术检测‘琯溪蜜柚果实发育不同时期和不同部位的CmPME1的表达特性。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验所用材料采自漳州市平和县小溪镇果园。采集时间为2013年7月16日至10月28日，约每隔10 d采集1次样品。取汁胞冻于液氮中，存放于-80 ℃。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取、检测及cDNA第一链的合成

柚汁胞总RNA提取参照钟凤林等[25]的Trizol方法提取，紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度。按照Trans ScriptⅡFirst-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒合成cDNA第一条链。

1.2.2 CmPME1基因ORF的克隆 采用Primer 5.0软件设计引物。根据甜橙基因组中PME中的cDNA序列，在起始密码子和终止密码子位置设计引物（见表1），引物合成与测序均委托上海博尚生物技术有限公司完成。

以琯溪蜜柚汁胞cDNA为模板，进行PCR扩增。反应体系为25 μL，其中10×Ex-TaqBuffer 2.5 μL，dNTPs（10 mmol）0.5 μL，上下游引物（10 μmol）各0.5 μL，模板cDNA1 μL，Ex-Taq（5 U/μL）0.15 μL，加水至终体积25 μL。反应程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 50 s，72 ℃ 2 min，35个循环；最后72 ℃再延伸10 min。PCR反应结束后电泳检测，将目的片段回收、连接、转化、测序。

1.2.3 CmPME1的荧光定量表达 实时荧光定量PCR引物的设计与合成：以‘琯溪蜜柚Tubulin基因为内参基因，根据已克隆的CmPME1基因的ORF序列，按照标准荧光定量PCR引物原则设计引物（表2）。

用试剂盒的方法分别提取‘琯溪蜜柚果实发育不同时期和不同部位汁胞的总RNA，每个样品进行3次生物重复，并以它们为模板，按照PrimeScript RT reagent kit（Perfect Real Time）试剂盒的方法合成cDNA第一链，-20 ℃保存备用。

荧光定量PCR在罗氏LightCycler 480荧光定量PCR仪上进行。将合成的cDNA（500 ng/μL）稀释10倍作为模板，进行荧光定量PCR。反应体系为20 μL：2×SYBR PremixEx TaqⅡ10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，cDNA模板1 μL，加ddH2O至终体积20 μL，每个样品进行3次技术重复。PCR反应程序采用两步法：95 ℃ 30 s（预变性过程）；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环（PCR反应过程）；95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min（熔解曲线分析过程）。根据荧光定量PCR目的基因CmPME1和内参基因β-Tubulin的Ct值，利用2-ΔΔCT（Livak）方法对果实发育不同时期和不同部位汁胞的CmPME1基因进行相对定量计算。

1.2.4 序列分析与生物信息学分析 采用ExPASy ProtParam（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）进行蛋白质理化性质的分析；采用Tmpered（http：//www.ch.embnet.org/software/tepred-form.html）进行跨膜结构预测与分析；采用PSORT（http：//psort.nibb.ac.jp/）进行亚细胞定位预测与分析；利用Mega 5.22进行系统进化树分析。

2 結果与分析

2.1 CmPME1 ORF序列的获得与CmPME1系统进化分析

CmPME1所扩增的ORF片段大小为1 748 bp（图1），经DNAMAN软件分析CmPME1编码582个氨基酸，ATG为起始密码子，TAA为终止密码子（图2）。经Blast比对发现，该氨基酸序列与陆地棉（Gossypium hirsutum）、可可树（Theobroma cacao）、毛果杨（Populus trichocarpa）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）的氨基酸序列的同源性分别达77%、76%、74%和71%，与甜橙（Citrus sinensis）的氨基酸序列同源性为99%。利用Mega 5.22近邻相接法（Neighbor-Joining，NJ）对CmPME1与来自12种不同物种的PME蛋白进行系统进化分析（图3）。从图3可以看出，12种不同植物的PME蛋白聚成一类，CmPME1和同属于柑橘属的甜橙的PME蛋白亲缘关系最近。

2.2 CmPME1编码蛋白理化性质和亚细胞定位预测分析

通过ProtParam软件对CmPME1蛋白进行基本的理化分析可知，相对分子量为63.37 ku，分子式为C2 784H4 428N796O851S22。该蛋白由20种氨基酸残基组成，其中丙氨酸（Ala）、丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）的含量较丰富，比例分别为9.8%、8.2%、7.9%；该蛋白含54个带负电的氨基酸（Asp+Glu）和66个带正电的氨基酸（Arg+Lys）， 总平均疏水指数-0.251，其理论等电点为9.16，不稳定指数为29.74，说明该蛋白属于稳定的碱性亲水性蛋白。

利用程序wolf psort分别对‘琯溪蜜柚CmPME1蛋白的亚细胞定位进行分析，CmPME1蛋白在线粒体内膜的分值最高，推测该蛋白定位在线粒体内膜。

2.3 CmPME1在果实发育不同时期和不同部位的表达

CmPME1在果实发育不同时期和不同部位的荧光定量表达如图4。从图中可以看出，随着时间的增加，CmPME1的表达量呈现先逐渐升高后逐渐降低趋势，在花后170 d表达量达到最高，远中柱汁胞CmPME1的表达量高于近中柱。

3 讨论与结论

目前，PME已经在很多植物中被克隆和研究，但在柚中未见报道。本研究克隆得到1条PME的ORF序列。系统进化树分析结果表明，CmPME1与其它植物的PME有较高的同源性。CmPME1氨基酸序列与甜橙亲缘关系最近，同源性高达99%。

大部分种类的果实中PME活性都随果实的成熟程度增强，使果胶、纤维素等细胞壁物质发生降解，从而导致果肉的软化[26-27]。荧光定量PCR结果表明，‘琯溪蜜柚果实的成熟过程中，CmPME1的表达量逐渐升高。可能与果实成熟过程中，果实变软有关。‘琯溪蜜柚果实汁胞粒化发生在果实生长后期，本研究CmPME1在花后170 d表达量最高，远中柱汁胞CmPME1的表达量高于近中柱。可能是由于柚果实汁胞在花后170 d左右开始发生粒化，粒化过程中CmPME1基因的表达量逐渐降低。Singh等[28]报道，粒化与果胶甲酯酶的活性呈负相关，粒化程度高的Kaula宽皮柑橘的果胶甲脂酶活性最低。而‘琯溪蜜柚果实汁胞粒化通常从囊瓣近蒂端汁胞发生，后渐向果心发展。Chakrawar等[29]也报道粒化果实的果胶甲酯酶活性比正常的低，并认为果胶甲酯酶与粒化有关。可见，近中柱CmPME1的表达量较远中柱低，可能是因为近中柱最易发生粒化，表达量较低。佘文琴等[30]研究了‘琯溪蜜柚果实发育过程中PME酶活性，发现其活性在9月28日达到最高，之后下降，这与CmPME1的表达量的变化趋势有一定相似性。但是否因粒化导致CmPME1的表达量下降还待进一步研究。

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