超高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱快速筛查保健品中23 种非法添加西药成分

张晓光，李　强，孙　磊，夏　静，张　岩，*

（1.河北省食品检验研究院，河北 石家庄 050091；2.河北省食品安全重点实验室，河北 石家庄 050091）

超高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱快速筛查保健品中23 种非法添加西药成分

张晓光1，2，李强1，2，孙磊1，2，夏静1，2，张岩1，2，*

（1.河北省食品检验研究院，河北 石家庄 050091；2.河北省食品安全重点实验室，河北 石家庄 050091）

建立基于超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱的快速筛查和确证保健品中可能非法添加的23 种降压类西药成分的方法。样品经过甲醇提取，用Acquity UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）分离，以甲醇和体积分数0.1% 甲酸溶液作为流动相进行梯度洗脱，采用正、负离子同时切换的扫描模式，在9 min内实现23 种西药成分 的检测。在全扫描模式下测定目标化合物的精确相对分子质量，与理论精确相对分子质量对比，相对质量偏差在 0.2×10－6～2.8×10－6之间，有效地去除了基质干扰；建立了23 种西药成分二级质谱数据库，实现对23 种西药成分的定性筛查及同步定量。添加水平为0.2、0.5 μg/kg和5.0 μg/kg时， 方法的回收率范围在72.3%～118.2%之间，相对标准偏差在0.5%～8.4%之间，检测限在0.2～0.5 μg/kg之间。该方法可以作为降压功效保健品中非法添加的西药成分的高通量筛选和确认检测方法。

超高效液相色谱；静电场轨道阱高分辨质谱系统；降压类药物；保健品

近年来，保健品产业迅速发展，其中用于辅助降压的保健品尤为居多，根据我国食品卫生法的相关规定，保健品中严禁添加任何西药成分，但仍有部分生产厂家为追求利益，向具有降压类保健品中违规添加西药成分。患者在不知情的情况下服用此类保健品，可能会对身体造成心跳加速、头疼、呕吐、贫血、颅内压增高、传导阻滞、出现幻觉、肝硬化等严重危害［1-3］。为遏制保健品中非法添加西药的行为，国家食品药品监督管理局于2009年颁布了降压类中成药中非法添加化学药物检验方法，但该方法仅适用于7 种常见降压药物的检测［4］。由于降压类新药的不断出现，非法添加的西药成分越来越复杂，并且非法添加西药成分种类呈现扩大趋势，因此研究快速准确筛查和精确定量降压药中非法添加西药成分的方法是很有必要的。目前，对于降压药中非法添加的西药成分的测定方法多为液相色谱法［5-6］、液相色谱-质谱联用法［7-10］、气相色谱-质谱联用法［11］，检测的非法添加西药种类较少，样品前处理复杂，且由于仪器性能限制问题，检出限无法满足要求，存在造成假阳性误判风险。

静电场轨道阱高分辨质谱是近来发展起来的新式的质谱，它的原理是利用不同物质在阱中运动轨迹不同而实现目标物的精确定量。它具有分辨率、灵敏度高的特点，能提供精确相对分子质量，可一次性采集高通量的数据，满足检测需求，由此弥补传统三重四极杆质谱方法检出限低、假阳性误判的不足；其数据依赖性扫描可以在筛查的同时，通过碎片离子进行定性确证［12］。近年来静电场轨道阱高分辨质谱在食品农药及生物毒素检测［13-17］、纺织品中禁用物质检测［18-19］、化妆品中激素检测［20］、代谢组学［21-22］等领域已开始应用，但在降压药物检测方面的应用未见报道。

本实验利用高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱快速检测保健品中可能非法添加的23 种降压西药成分，采用全扫描和正、负离子切换模式进行测定，通过提取的二级质谱进行定性，提取一级质谱的精确相对分子质量进行定量，利用基于母离子列表的数据依赖采集构建二级质谱库保证了测定结果的准确性。该方法用实际添加实验进行验证，在较低质量浓度添加水平条件下仍可以保证良好的检测结果。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

保健品 市购；23 种西药标准品（纯度≥95%）中国食品药品检定研究院；甲醇、甲酸（色谱纯） 德国Merck公司；实验用水为去离子水；标准储备液用甲醇配制，系列标准工作溶液用甲醇-水（1∶9，V/V）配制。

1.2仪器与设备

Q-Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱（配有H-ESI Ⅱ源）、Ultimate 3000液相色谱系统 美国Thermo Fisher Scientifi c公司。

1.3方法

1.3.1样品前处理

准确称取一定量降压类保健品（固体样品2.0 g、液体样品5.0 g、胶囊状态样品除去囊壳后称量），精确至0.01 g，于50 mL离心管中，加5 mL水、25 mL甲醇，40 ℃涡旋混匀，超声提取15 min。冷却后用甲醇定容至50 mL。10 000 r/min离心5 min，取上清液25 mL，于45 ℃水浴条件下氮气吹干。准确加入甲醇1.0 mL，涡旋30 s，过0.45 μm有机滤膜到进样瓶中，供液相色谱-质谱仪测定。

1.3.2仪器条件

1.3.2.1色谱条件

色谱柱：Acquity UPLC BEH C18柱（50 mm× 2.1 mm，1.7 μm）。流动相：A，甲醇；B，体积分数0.1%甲酸溶液。梯度洗脱，洗脱程序：0～0.5 min，10% A；0.5～3.0 min，10%～95% A；3.0～7.5 min，95% A；7.5～8.0 min，95%～10% A；8.0～9.0 min，10% A。流速0.30 mL/min；柱温：室温；进样体积2 μL；分析时间9 min。

1.3.2.2质谱条件

电喷雾离子源温度310 ℃；毛细管电压3 800 V（正、负离子同时进行模式）；一级质谱驻留时间100 ms；二级质谱驻留时间50 ms；质量扫描范围：m/z 200～700；分辨率（R）：70 000；扫描模式：全扫描+自动触发二级质谱扫描；气化温度300 ℃；鞘气压（N2）35 arb；辅助气压（N2）10 arb；离子传输管温度320 ℃；二级质谱采用自动触发方式产生碎片离子，碰撞裂解气为高纯氮气，碰撞能量为35%。

2　结果与分析

2.1样品的提取与色谱柱的选择

样品提取可以选择的溶剂有水、甲醇、乙腈、乙醇等。根据23 种化合物的物理溶解性质，决定采用水加有机溶剂的混合溶液作为提取溶剂，选取了具有代表性的固体样品和液体样品，加入23 种西药成分混合标准品至1 μg/g，以1.3.1节方法进行样品前处理，以平均加标回收率对比甲醇-水、乙腈-水、乙醇-水3 种溶剂体系，发现以甲醇-水作为混合溶剂提取时23 种西药成分平均回收率相对较高，最终选取了甲醇-水混合溶剂进行提取。在色谱柱的选择方面，比较了不同类型的C18反相色谱柱：Acquity UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Broshell 120 SB-C18柱（100 mm×3.0 mm，2.7 μm）、Hypersil Gold C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），在相同的液相体系条件下，Acquity UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Broshell 120 SB-C18柱（100 mm×3.0 mm，2.7 μm）均能实现较好分离度，而Acquity UPLC BEH C18柱用时更短；从分离效果和出峰时间两方面综合考虑，最终选择了Acquity UPLC BEH C18柱。

2.2快速筛查验证及谱库的建立

2.2.1理论精确相对分子质量的验证

正负离子扫描有不分段切换和分段切换2 种方式，在常规多目标物定量分析时常采用正、负离子切换方式以提高分析检测的通量。本方法为避免分段式采集容易出现的保留时间漂移导致漏检的现象，提高筛查的准确性，采用正、负离子切换不分段全扫描的方式，23 种降压药出峰图谱见图1，23 种降压药物色谱-质谱检测在9 min内完成，同时保持较好的质量精度。正、负离子同时采集的质量精度见表1。

表1　23种化合物同时采集的质谱分析参数Table1　Analytic parameters of 23 target compounds using UPLC Orbitrap MSap MS

表1中，23 种物质中吲达帕胺、氢氯噻嗪、氯沙坦钾为负模式扫描，其余均为正模式扫描。负模式扫描得到为［M－H］－图谱，正模式扫描得到［M+H］+图谱，盐酸可乐定、盐酸贝那普利、盐酸哌唑嗪、盐酸尼卡地平均为去掉［HCl］基团精确相对分子质量，马来酸依那普利为去掉［C4H4O4］基团得到的精确相对分子质量；苯磺酸氨氯地平为去掉［C6H6O3S］基团得到的精确相对分子质量；酒石酸美托洛尔分子式以［C15H25NO3］计［23］，在分辨率为70 000的情况下，23 种降压药物精确度相对质量偏差在0.2×10－6～2.8×10－6之间（表1），相对分子质量变化较小，可以满足根据保留时间，理论相对分子质量和多电荷同位素特征峰对样品进行快速筛查［24-25］。

图1　23种目标化合物提取一级质谱图Fig.1 Mass spectra of 23 target compounds

2.2.2筛查准确性的验证

采用Extract Finder软件对保健品中西药成分进行初步筛查，首先构建降压类药物化合物列表，设置相应的检索参数，如保留时间、相对分子质量偏差、二级质谱匹配度等。软件会计算实际样品和理论标准品之间的分子离子的精确相对分子质量偏差、同位素分布匹配度、同位素比例和保留时间偏差，综合多个参数进行评价，对于检索结果得分不小于70的化合物，本方法确认其为阳性样品。

2.2.3基于二级质谱图库的筛查方法的建立

使用高分辨质谱分析药物，只采集一个母离子不能满足相关法规指令中规定的定性最低要求，必须进行二级质谱扫描获得足够多的定性信息。图2是23 种降压药物标准样品的二级质谱图。利用Exact Finder软件将23 种标准品的二级谱图建立成二级质谱库，以保留时间、一级精确相对分子质量、二级图谱匹配度、同位素峰形匹配度等4 个指标作为打分依据，将4 个指标设定不同的阈值，实际样品分析可以通过软件进行打分判定，综合打分不小于70 分即判定为疑似阳性样品。

图2　23种目标化合物标准样品的二级质谱图Fig.2　Tandem mass spectra of 23 target compounds

2.3同步定量方法的线性范围、检测限、回收率和精密度

本方法在快速筛查的基础上通过提取一级质谱的精确相对分子质量进行定量从而实现同步定量分析，无需阳性样品的重新定量分析。

以23 种降压药物质标准品的峰面积为纵坐标，相应的质量浓度（ng/mL）为横坐标，进行线性回归计算，得到线性方程和相关系数。23 种分析物的线性方程相关系数均大于0.99。确定该方法的检出限、定量限、线性方程、线性范围具体数据见表2。

表2　23种化合物线性方程、检测限及定量限Table2　Regression equations with correlation coefficients， LOD and LOQ for 23 target compounds

表3　23种降压药物的回收率和精确度Table3　Recoveries and RSDs of 23 target compounds spiked into blank matrix sample

在空白基质中添加23 种降压药物标准溶液，添加水平分别为0.2、0.5 μg/kg和5 μg/kg，每个添加水平平行测定6 次，回收率范围在72.3%～118.2%之间，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）范围为0.5%～8.4%；23 种降压药物在3 个水平条件下的回收率和精密度实验结果见表3。

2.4实际样品的测定

利用本方法对购自超市的10 个不同品牌的10 份保健品进行了筛查分析，均未检出上述23 种降压类西药成分。

3　结 论

本实验利用高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱对保健品中可能非法添加的降压类药物进行测定，9 min内可完成23 种降压类药物的高通量筛选和确认。高分辨率质谱在样品分析中消除了基质干扰，提高了定性和定量的准确性，自动触发全扫描二级质谱进一步提高了定性的准确性。以精确相对分子质量和二级质谱图为基础，构建了降压类药物数据库，建立了保健品中非法降压类药物的快速筛查和确证方法。该方法灵敏度较高，并且自建的质谱数据库可以不断扩充。该方法作为一种快速筛选和确证检测技术必将在保健品中非法添加物筛查和确认中得到广泛应用。

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Rapid Screening and Confirmation of 23 Illicit Western Medicine Components in Health Food Products by Ultra High Performance Liquid Chromatography-Orbitrap High Resolution Mass Spectrometry

ZHANG Xiaoguang1，2， LI Qiang1，2， SUN Lei1，2， XIA Jing1，2， ZHANG Yan1，2，*
（1. Hebei Food Inspection and Research Institute， Shijiazhuang 050091， China；2. Key Laboratory of Food Safety of Hebei Province， Shijiazhuang 050091， China）

A high performance liquid chromatography-linear ion trap/orbitrap high-resolution mass spectrometry（Orbitrap MS） method was developed for rapid screening and detection of 23 illicit western medicine components with antihypertensive effi cacy in health foods. The samples were extracted with methanol， and the extracts were then separated on an Acquity UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm， 1.7 μm） using a binary solvent system composed of methanol and 0.1% formic acid in water by gradient elution. Both positive ion scan mode and negative ion scan mode were used to detect 23 western med icine components within 9 m inutes. The relative molecular masses of the target compounds were obtained in full scan mode with a relative deviation in the range of 0.2×10-6to 2.8×10-6compared to the theoretical value， indicating effective elimination of the matrix interference. Tandem mass spectrometric database based on characteristic fragment ions for the 23 western medicines was built. This method allowed qualitative screening and quantitative analysis at the same time. Recoveries of the proposed method were in range of 72.3%-118.2% at spike levels of 0.2， 0.5 and 5.0 μg/kg with relative standard deviations （RSDs） between 0.5% and 8.4%， and the limits of detection were between 0.2 and 0.5 μg/kg. As a high-throughput and confi rmatory method， it is useful for the determination of illicit western medicines as antihypertensive agents in health foods.

ultra high performance liquid chromatography （UPLC）； orbitrap high resolution mass spectrometry；antihypertensive medicines； health food products

TS207.3

A

1002-6630（2015）14-0187-05

10.7506/spkx1002-6630-201514036

2014-12-10

河北省科技条件建设项目（13965504D）

张晓光（1983—），男，硕士研究生，研究方向为食品科学。E-mail：daniou2002@foxmail.com

张岩（1979—），男，高级工程师，博士，研究方向为化学生态学。E-mail：snowwinglv@126.com