PDGF-BB对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞增殖和细胞周期的影响

罗金泰余文俊韦安阳袁 坚曾国华

1. 广州医科大学第一附属医院微创外科中心泌尿外科（广东省泌尿外科重点实验室）（广州 510230）；2. 南方医科大学南方医院惠侨楼泌尿外科

PDGF-BB对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞增殖和细胞周期的影响

罗金泰1*余文俊1韦安阳2袁 坚1曾国华1

1. 广州医科大学第一附属医院微创外科中心泌尿外科（广东省泌尿外科重点实验室）（广州 510230）；2. 南方医科大学南方医院惠侨楼泌尿外科

目的 探讨血小板源性生长因子BB（PDGF-BB）对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞（CCSMC）增殖和周期的影响。方法 使用改良组织块贴壁法原代培养大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞，将细胞分为空白对照组和不同浓度PDGF-BB处理组，分别采用MTS法和流式细胞术检测PDGF-BB对CCSMC增殖和周期的影响。结果 MTS法提示PDGF-BB促进CCSMC增殖，且在一定时间范围和浓度范围内分别呈时间依赖和浓度依赖；流式细胞术结果显示PDGF-BB作用后G0/G1期细胞由（90.79±3.46）%减少至（77.57±5.72）%；而S期的细胞由（7.85±2.68）%升高至（16.47±4.42）%；G2/M期由（2.46±1.25）%升高至（5.96±2.18）%，两组间差异具统计学意义（P＜0.05）。结论 PDGF-BB可促进大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞增殖。

血小板源性生长因子； 肌细胞，平滑肌； 细胞增殖； 细胞周期

血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）是体内一种强效促有丝分裂剂，在细胞的增殖、分化、组织损伤的修复及动脉粥样硬化斑块形成中起重要作用。PDGF对血管平滑肌细胞相类似的阴茎海绵体平滑肌细胞（corpus cavernosum smooth muscle cell，CCSMC）是否有促进其增殖的作用，目前尚不清楚。本研究将探讨PDGF-BB对促进CCSMC增殖的影响。

材料与方法

一、材料

SD大鼠购于广东省实验动物中心，DMEM培养基、胎牛血清购于美国Gibco公司，PDGF-BB购于美国R&D公司，MTS购于美国Premoga公司。

二、方法

（一）CCSMC原代培养

采用改良组织块法原代培养CCSMC，选取200g左右7周龄雄性SD大鼠1只（清洁级），断颈椎处死大鼠，以75%酒精浸泡大鼠约3 min。在无菌条件下快速切开包皮，在阴茎脚水平横行切取阴茎，迅速移入含有双抗的PBS缓冲液中，去除阴茎软骨、尿道、纤维、脂肪及血管等组织。经PBS漂洗2次洗去血细胞后，将海绵体组织剪成（0.5～1）mm3组织块，按0.5 cm的间隔放置到涂有含20%胎牛血清的DMEM/ F12培养基的25 mL培养瓶内，再将培养瓶翻转使组织块位于上方，5 h后翻转培养瓶，使组织块与培养基接触，在37℃、5%CO2、95%空气的培养箱中培养。4 d左右见有细胞从组织块爬出，遂剔除组织块。细胞融合至约90%时用胰酶消化细胞，后加入含10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化，制成单细胞悬液，静置20min后将细胞悬液转移至另一个培养皿中，再次静置、贴壁，如此重复两次后，将培养皿放入37℃、5% CO2培养箱中培养。待细胞融合至约90%时，按1:3传代培养。

（二）CCSMC鉴定

1. 细胞形态学观察：倒置显微镜下观察细胞大小、形态和生长特点等。

2. α- SMA免疫荧光染色：将约1×105个细胞接种于含无菌载玻片的12孔板中，培养细胞至80%～90%融合后，弃去培养基，PBS洗涤5min×3次，用4%多聚甲醛固定30min，PBS洗涤5min×3次，0.3%Triton X-100破膜3min，PBS洗涤5min×3次，5%BSA封闭45min，吸去BSA，SMA一抗（1:200稀释）4℃孵育过夜，PBS洗涤5min×3次，荧光二抗（1:200稀释）避光室温孵育45min，PBS洗涤5min×3次， DAPI染核，PBS洗后甘油封片，荧光显微镜下观察并采集图像。

（三）实验分组

原代培养的2-4代大鼠CCSMC用于实验。实验分为空白对照组和不同浓度（5、10、20、40ng/mL）PDGF-BB组，不同浓度PDGF-BB作用细胞24h。以及空白对照组和20ng/mL PDGF-BB作用细胞不同时间（24、48、72h）组。

（四）MTS法检测细胞增殖能力

将制备的CCSMC悬液接种在96孔培养板中，每孔接种含5×103个细胞的培养液100μL。经CO2培养箱孵育24 h，换无血清的DMEM培养液同步化细胞24 h，分为1%FBS培养基空白对照组及1%FBS培养基加不同浓度PDGF-BB（5、10、20、40ng/mL）的各组，每组设5个复孔，分别继续培养1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d，行MTS检测，每孔加入MTS20μL，于37℃、5% CO2培养箱内孵育4h后，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定各孔吸光值，记为A490。

（五）流式细胞术检测细胞周期

处于对数生长期的细胞，用无血清培养基培养24h，使细胞同步化，再将其分为空白对照组与20ng/mL PDGF-BB处理组继续培养24h，消化细胞，离心及PBS漂洗，75%冰乙醇中固定，4℃过夜，次日离心并用PBS漂洗，弃上清液后每管加500μL PBS，25μL PI，2.5μL RnaseA溶液，37℃水浴1h，300目滤网过滤后上机检测。

三、统计学处理

数据采用SPSS 13.0统计软件进行处理，计量资料用均数±标准差表示，两样本均数比较采用t检验，多样本均数两两比较采用单因素方差分析。

结 果

一、阴茎海绵体平滑肌细胞生长情况及鉴定

倒置相差显微镜观察：原代培养第4天，可见少许CCSM从组织块边缘爬出，形态多样，大部分呈梭型，见图1A。当细胞生长至融化后，部分区域呈多层重叠，部分呈单层，高低起伏，呈现平滑肌细胞特征性的“峰-谷”样生长，见图1B。α-SMA免疫荧光鉴定：荧光显微镜下可见绿色荧光分布在胞核和胞浆中，阳性率达95%以上，见图1C。

图1 CCSMC生长情况及鉴定A: CCSMC从组织块中爬出（×40）； B: CCSMC呈“峰-谷”样生长（×100）； C: CCSMC免疫荧光染色α-SMA阳性表达（×200）

二、PDGF-BB对CCSMCs增殖的影响

MTS结果显示，与对照组相比，PDGF-BB刺激后，CCSMCs增殖能力均增强，随着时间的增加，增殖能力逐渐增强，第5天达到峰值，随后增殖能力开始减弱，在一定时间范围内呈时间依赖；一定浓度范围内PDGF-BB刺激后CCSMCs增殖能力随浓度增加而增强，呈浓度依赖，20ng/mL PDGF为峰浓度，与其他组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图2 PDGF-BB对CCSMCs增殖的影响MTS检测不同浓度（0、5、10、20、40ng/mL）PDGF-BB作用CCSMCs不同时间（1～7d）后细胞的增殖情况。第5天达到增殖高峰，20ng/mL PDGF为峰浓度

三、PDGF-BB对CCSMCs周期的影响

流式细胞术检测结果显示，与对照组比较G0/G1期细胞由（90.79±3.46）%减少至（77.57±5.72）%；而S期的细胞由（7.85±2.68）%升高至（16.47±4.42）%；G2/M期由（2.46±1.25）%升高至（5.96±2.18）%，两组间差异显著（P＜0.05），见图3。

讨 论

勃起功能障碍（erectile dysfunction，ED）是中老年男性的常见病、多发病。近年来，随着生活、工作、心理等各方面的压力逐步加大，ED的患病率呈现不断增高并出现年轻化的趋势。ED的发生发展是一个多因素、多步骤的复杂过程。目前ED的具体发病机制尚不明确，有研究表明低氧与ED有着密切的关系，认为低氧引起ED的机制主要是海绵体纤维化学说，而另一种可能机制是产生引起血管紧张度增加的各种因子，如血小板源性生长因子、血管内皮素和血管内皮生长因子等［1，2］。有学者采用大鼠海绵体体外模拟低氧环境，发现短暂的低氧能够导致大鼠海绵体PDGF及其受体过表达，长期则会导致海绵体纤维化［3］。

PDGF是一类强有效的促有丝分裂剂和化学诱导剂［4］。PDGF有5种亚型，分别为PDGF-AA、PDGFAB、PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD，其中PDGFBB被认为是其家族中促进有丝分裂能力最强的成员。PDGF必须与细胞表面相关受体结合后，才能激活胞内信号传导通路，通过自分泌或旁分泌的方式发挥生物学效应，参与胚胎发育、组织修复、正常生理活动及多种疾病（如纤维增生性疾病、动脉粥样硬化和肿瘤）的发生发展等多项生命活动［5-8］。目前己发现多条相关信号传导路径［9，10］，如ERK通路，PI3K/ Akt通路，MAPK通路，PLC通路，Src通路，Ca2+通路，JAK/STAT通路，PKA通路，G蛋白耦联受体等。以上多种信号传导途径相互联系，形成一个庞大而复杂的信号网络，共同调节PDGF对细胞的作用。

PDGF-BB是否可以促进CCSMC增殖目前未见报道，本文是首次报道PDGF-BB对CCSMC增殖的影响。本研究通过MTS检测PDGF-BB对CCSMC增殖的影响。MTS结果提示PDGF-BB的作用在一定时间范围和浓度范围内分别呈时间依赖和浓度依赖，PDGFBB刺激后第5天达到增殖高峰而后细胞逐渐凋亡，20ng/mL PDGF-BB为促增殖的峰浓度。

图3 PDGF-BB对CCSMCs周期的影响A: 对照组流式细胞检测细胞DNA直方图； B: PDGF组流式细胞检测细胞DNA直方图； C: PDGF-BB作用后CCSMC细胞周期的变化情况， 细胞经过PDGF-BB作用后G0/G1期细胞减少， S期细胞增加， G2/M期增加，*P＜0.05 与对照组比较

同时，为进一步探讨PDGF-BB促阴茎海绵体平滑肌细胞增殖的可能作用机制。本研究还应用流式细胞仪观察PDGF-BB对细胞DNA合成和细胞周期的影响。G1为DNA合成前期，此期为过渡至S期作准备，发生的是与DNA合成有关的生化变化；S期为DNA合成期，可反映细胞的分裂活力，增殖旺盛的细胞处于S期的比例较高；G2为DNA合成后期，M期为有丝分裂期，（S+G2M）%为增殖指数，代表了细胞中增殖细胞的数量，在一定程度上反映细胞的增殖状态。本实验结果显示，PDGF-BB处理组G1期细胞减少，S期与G2/M期细胞增多，其可能作用机制是促使静止态的G1期细胞活跃而向S期转变，使DNA合成量增加，从而促进细胞的增殖。实验结果进一步验证了PDGFBB作用后CCSMC处于增殖状态。

通过以上研究证实PDGF-BB可促进大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞增殖，然而其具体机制仍不清楚，有待进一步深入研究，为ED发病机制的明确和疾病的治疗提供理论基础。

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（2015-05-25收稿）

The effects of PDGF-BB on cell proliferation and cell cycle of corpus cavemosum smooth muscle cells in SD rat

Luo Jintai1*， Yu Wenjun1， Wei Anyang2， Yuan Jian1， Zeng Guohua1
1. Department of Urology， Minimally Invasive Surgery Center， The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University. Guangdong Key Laboratory of Urology， Guangzhou 510230， Guangdong， China
2. Division of Urinary Surgery， Huiqiao Department， Nanfang Hospital， Southern Medical University

Luo Jintai， E-mail: 2961944548@qq.com， Tel: 13922449294

Objective To evaluate the effect of the platelet-derived growth factor-BB （PDGF-BB） on cell proliferation and cell cycle of corpus cavemosum smooth muscle cells （CCSMCs） in SD rat. Methods CCSMCs were primarily cultured and subjected to immunocytochemical assay. The cells were divided into different concentrations of PDGF-BB groups and a nromal control group. The MTS method and fi ow cytometry were used respectively to detect cell proliferation and cycle. Results MTS analysis suggested PDGF-BB increased CCSMC proliferation， and exhibited time dependent and concentration dependent mode； Flow cytometry results showed that the proportion of cells in G0/G1 phase decreased from（90.79±3.46）% to （77.57±5.72）%； And the proportion of cells in S phase was increased from （7.85±2.68）% to （16.47±4.42）%；G2/M phase cells from （2.46±1.25）% to （5.96±2.18）%， there were signifi cant differences between the two groups （P＜0.05）. Conclusion PDGF-BB may promote rat corpus cavernosum smooth muscle cell proliferation.

platelet-derived growth factor； myocytes， smooth muscle； cell proliferation； cell cycle

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.09.006

R 698.1

*通讯作者， E-mail: 2961944548@qq.com， Tel: 13922449294