SO2和BaP复合暴露诱导小鼠肺线粒体损伤的分子机制

秦国华，武美琼，桑 楠 （山西大学环境与资源学院，山西 太原 030006）

SO2和BaP复合暴露诱导小鼠肺线粒体损伤的分子机制

秦国华*，武美琼，桑 楠 （山西大学环境与资源学院，山西 太原 030006）

采用C57BL6小鼠作为模型，SO2（7mg/m3）动式吸入染毒28d，每天染毒6h；SO2熏气开始后的第1～5d，腹腔注射BaP（40mg/kg b.w.），一天一次.吸入染毒结束后，采用分光光度计法检测小鼠肺线粒体膜电位（MMP）以及细胞色素C氧化酶（COX）的活性；采用荧光定量PCR技术，检测肺细胞中细胞色素C氧化酶亚基CO4以及核转录因子PGC1-α、NRF1、mtTFA的mRNA水平；并采用Western blot技术检测上述三种线粒体调控基因的蛋白表达.结果发现，在SO2和BaP复合暴露后，小鼠肺线粒体膜电位下降，氧化磷酸化复合体COX活性和亚基CO4的mRNA表达水平显著降低，调控基因NRF1和mtTFA的mRNA和蛋白水平也显著下调.提示小鼠在SO2和BaP复合暴露后，可能通过降低肺中NRF1表达，影响其对mtTFA的调控，进一步抑制相关基因组的转录和翻译，最终可能导致小鼠肺线粒体的氧化磷酸化功能受损，线粒体膜电位下降进而引发肺部疾病.

SO2；BaP；线粒体；细胞色素C氧化酶；线粒体膜电位；CO4；NRF1；mtTFA

SO2与PAHs都是典型煤烟型大气污染物中重要的组成成分，由于排放源与传输模式相似，在大气中往往同时存在.本实验室研究发现，SO2是一种全身性毒物［1］，可引起小鼠肺超微结构不同程度改变，其中以线粒体受损伤最严重［2］.线粒体是氧化磷酸化的主要场所，而亚硫酸盐的毒性与线粒体氧化磷酸化功能受损有关［3］.苯并［a］芘（BaP）是一种典型的PAHs，可诱发动物发生肿瘤，与人类肺癌的发生也密切相关.线粒体也是 BaP的靶器官，研究表明BaP可以诱导线粒体损伤和凋亡.细胞色素 C是核呼吸因子（NRF1）的靶基因［3］.最新研究报道，对人支气管上皮细胞进行BaP暴露后，NRF1和线粒体转录因子A（mtTFA）的表达下调［4-5］.

SO2与BaP均可诱导线粒体损伤，但前期研究大多是单独暴露后的分子机制探讨，关于二者复合污染诱导线粒体损伤的分子机制尚未见报道.

因此，本实验通过检测线粒体膜电位（MMP）、细胞色素C氧化酶（COX）的活性、COX亚基CO4的mRNA水平及线粒体氧化磷酸化调控基因PGC1-α、NRF1、和mtTFA的mRNA和蛋白表达，对SO2和BaP复合暴露诱导小鼠肺线粒体损伤的分子机制进行了简单的探讨.

1　材料与方法

1.1 实验动物处理

C57BL6品系雄性小鼠（体重18～20g）24只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，随机分成4组，每组6只，分别为对照组、SO2组、BaP组、SO2+BaP组.小鼠于不锈钢笼中，12h昼夜循环，保证外界温度为（24±2）℃，湿度为50%±5%.其中SO2组和SO2+BaP组在1m3的玻璃熏气箱中进行 SO2（7mg/m3）动式吸入染毒［6］，每天6h，共28d.对照组和BaP组接受过滤的新鲜空气.箱顶的电动搅拌扇可以保证箱内气体浓度均匀一致，箱内SO2浓度采用盐酸副玫瑰苯胺分光光度法分析测定，每 30min测定一次.动物染毒期间禁食禁水，其余时间自由进食和饮水（自来水）.SO2熏气开始后的前 5d，BaP组和SO2+BaP组进行腹腔注射溶于橄榄油的BaP（40mg/kg b.w.）［7］；而对照组和SO2组只注射橄榄油.熏气结束禁食 18h后将动物脱颈处死，取肺，一部分用于线粒体提取，一部分放入液氮中速冻后，转入-80℃冰箱中保存.

1.2线粒体提取

取新鲜的肺组织40mg于Buffer A（胰酶，需要现配现用，浓度为0.25mg/mL，用1x Buffer B定容）中匀浆， 600×g离心5min，取上清， 11000×g离心10min后，加1mL Buffer B （10mmol/L Hepes，200mmol/L mannitol，70mmol/L sucrose，1mmol/L EGTA）重悬沉淀.重复上述离心一次，加Buffer C （10mmol/L Hepes， 0.25mmol/L sucrose， 1mmol/L ATP， 0.08mmol/L ADP， 5mmol/L sodium succinate 2mmol/L K2HPO4， 1mmol/L DTT）.重悬线粒体.采用考马斯亮蓝法测定线粒体蛋白.

1.3JC-1测定线粒体膜电位

亲脂性阳离子探针JC-1测定肺线粒体膜电位（MMP）.使用分析 Buffer（20mmol/L MOPS，110mmol/L KCl，10mmol/L ATP，10mmol/L MgCl2，10mmol/L sodium succinate，1mmol/L EGTA）将JC-1稀释至0.2μg/mL，37℃孵育20min，490nm激发光，590nm发射光检测荧光强度.MMP用荧光单位（FLU）/mg pro来表示.

1.4细胞色素C氧化酶活性检测

比色法测定样品中细胞色素C氧化酶活性，使用细胞色素 C氧化酶检测盒来分析测定（Sigma-Aldrich， St. Louis， MO）.

1.5mRNA的提取与荧光定量PCR

取60mg的肺组织，用Trizol提取总RNA，采用 PrimeScriptTM反转试剂盒合成 cDNA.使用Analytik Jena荧光定量PCR仪进行扩增，扩增所需引物均采用Primer Premier 5.0软件设计，引物序列见表 1.PCR体系为 20 μL，其中含有 1μL cDNA，10μL SYBR Premix Ex Taq，上下游引物各1μL和 7μL H2O.反应条件为：95℃预变性 3min；95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸20s，45个循环；最后在 60～72℃获得溶解曲线.由标准曲线获得样品目的基因的浓度，结果以目的基因与β-actin基因表达的比值来表示.

表1　荧光定量PCR所用引物序列Table 1 Primers used in real-time RT-PCR

1.6蛋白提取与Western blot

取40mg肺组织，加1mL蛋白工作液匀浆，蛋白工作液成分为：1% Nonidet P40， 1mmol/L EDTA， 125mmol/L sodium fluoride， 0.5mmol/L sodium vanadate， 2.5μg/mL aprotinin， 5μg/mL pepstatin， 50μg/mL leupeptin， 25μmol/L PMSF，25μg/mL trypsin inhibitor. 4℃放置20min，13000r/min，离心 15min，取上清，考马斯亮蓝法测蛋白浓度.采用Western blot方法检测目的基因的蛋白表达情况.以 50μg的蛋白上样，使用聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）法分离蛋白，将目的蛋白电转PVDF膜上，封闭，一抗过夜孵育，荧光二抗孵育之后使用Odyssey红外扫描仪进行扫描.

1.7数据处理

用SPSS统计软件分析数据，用origin 8.0作图.结果以均值±标准误（mean±SE）来表示，用One-way ANOVA法检验染毒组与对照组的显著性差异.

2　结果

2.1SO2和BaP复合暴露对小鼠肺线粒体膜电位的影响

图1　SO2和BaP复合暴露对小鼠肺线粒体膜电位的影响Fig.1 Effect of SO2and BaP co-exposure on the inner mitochondrial membrane potential in mouse pulmonary cell

图1所示为SO2和BaP复合暴露后小鼠肺线粒体膜电位的变化，与对照组相比，SO2和BaP复合暴露显著降低了 JC-1的荧光信号，是对照组的0.82倍；而SO2和BaP单独作用组没有显著变化.

2.2SO2和BaP复合暴露对小鼠肺细胞色素C氧化酶活性的影响

如图2所示，对小鼠进行SO2和BaP复合暴露，发现 BaP组和 SO2+BaP组与对照组相比，COX活性显著下降，而SO2组没有显著变化.

图2　SO2和BaP复合暴露对小鼠肺细胞色素C氧化酶活性的影响Fig.2 Effect of SO2and BaP co-exposure on cytochrome oxidase activity in mouse pulmonary cell

2.3SO2和BaP复合暴露对小鼠肺线粒体细胞色素C氧化酶（COX）亚基CO4 mRNA表达水平的影响

CO4是细胞色素C氧化酶（COX）的一个亚基.与对照组比较，SO2和 BaP复合暴露使 CO4 mRNA表达水平显著下调，而污染物单独作用并没有显著变化（图3）.

2.4SO2和BaP复合暴露对小鼠心脏线粒体氧化磷酸化过程中调控基因mRNA表达水平的影响

SO2和 BaP复合暴露组与对照组相比，线粒体调控基因PGC1-α的mRNA表达水平无显著性差异，但 NRF1和 mtTFA显著降低.而SO2和BaP单独组3个调控基因均无显著变化（图4）.

图3　SO2和BaP复合暴露对小鼠肺线粒体COX亚基CO4 mRNA表达水平的影响Fig.3 Effect of SO2and BaP co-exposure on mRNA levels of CO4 in mouse pulmonary cell

图4　SO2和BaP复合暴露对PGC1-α、NRF1和mtTFA 的mRNA表达水平的影响Fig.4 Effect of SO2and BaP co-exposure on mRNA levels of PGC1-α，NRF1 and mtTFA in mouse pulmonary cell

2.5SO2和BaP复合暴露对小鼠肺线粒体氧化磷酸化过程中调控基因蛋白表达水平的影响

如图5所示，SO2单独作用与对照组相比，并没有产生损伤PGC1-α的蛋白表达，但NRF1和mtTFA的表达显著下调，是对照组的 0.30、0.34 倍.小鼠暴露于BaP后，3个调控基因蛋白水平均显著下降，分别为对照组的 0.51、0.31、0.53 倍.NRF1和mtTFA的蛋白表达在SO2+BaP组，与对照组相比有统计学意义上的显著性差异，分别为对照组的0.51、0.38倍；而PGC1-α的表达无显著性变化.

图5　SO2和BaP复合暴露对PGC1-α、NRF1和mtTFA的蛋白表达水平的影响Fig.5 Effect of SO2and BaP co-exposure on protein levels of PGC1-α， NRF1 and mtTFA in mouse pulmonary cell

3　讨论

线粒体是氧化磷酸化的主要场所，正常的线粒体膜电位（MMP）是维持线粒体进行氧化磷酸化、产生三磷酸腺苷的先决条件.当某些病因导致呼吸链电子传递过程障碍时，就会导致 MMP耗散，进而引起通透性转换孔（MTP）开放等一系列调亡级联反应.MMP的耗散和细胞色素C的释放是引起细胞凋亡的上游事件，同时也是线粒体损伤的标志［8］.其中细胞色素 C氧化酶（COX）是线粒体呼吸链电子传递的终末复合酶，CO4是细胞色素C氧化酶的一个亚基.当呼吸链蛋白表达发生改变时，必然引起呼吸链电子传递过程障碍并最终发生氧化磷酸化功能下降、MMP耗散、细胞凋亡等一系列反应［9］.

SO2和BaP复合暴露后，与对照组比较，小鼠肺线粒体中不仅MMP和COX活性显著性下降；同时我们也观察到COX的亚基CO4mRNA表达显著下调（图1、图2、图3）.而且在诱导MMP下降上，SO2和 BaP有一定的协同作用（图 1）. Yang［10］对人胎儿肺成纤维细胞进行BaP不同时间和剂量染毒，实验结果揭示，BaP首先刺激ROS的大量产生，进而引起线粒体的去极化，如MMP的降低以及细胞色素C的释放.在对小鼠肝癌细胞的研究中也证实，BaP可诱导线粒体膜通透性转运通道的开放，引起膜电位的下降和细胞色素C的释放［11］.COX活性在SO2慢性暴露下不受影响，而在BaP组和复合暴露组下降，提示活性氧产生量在BaP及SO2与BaP复合暴露组可能要比SO2单独暴露组更多，从而对线粒体呼吸链蛋白的影响也更为严重.有报道证明，亚硫酸盐可增加BPDE的致突变性，使BPDE与核DNA的结合增加［12-14］.SO2和BaP复合暴露可诱导由nDNA编码的亚基CO4mRNA表达显著下调，但BaP单独作用并无明显变化（图3）.说明SO2和BaP在长期共同作用下，对nDNA编码的线粒体亚基也造成了损伤，SO2可增加BaP对线粒体的损伤.

而本研究对小鼠进行SO2吸入染毒28d后，发现 PGC-1α mRNA和蛋白水平没变化；但是NRF1和mtTFA在mRNA水平上无显著下降，在蛋白水平有统计学意义上的差异（图4、图5）.这揭示 SO2极有可能在转录后或翻译水平调控NRF1和mtTFA的表达.在对人支气管上皮细胞的研究中发现，NRF1是BaP诱导的线粒体损伤的关键原因，并与mtTFA的蛋白表达相关，伴随着MPT的开放和ROS的大量产生［4］.图4和图5显示，BaP在转录后和翻译水平调控 PGC-1α，NRF1和mtTFA的表达；而SO2和BaP复合暴露后，小鼠肺线粒体调控基因NRF1和mtTFA在mRNA和蛋白水平均显著下调，相较于单独作用组只在蛋白水平的下调，复合暴露组显然对线粒体损伤更严重.这提示，活性氧产生量在SO2+BaP组可能要比SO2或BaP单独暴露组更多，从而对线粒体呼吸链蛋白的影响也更为严重.NRF1和mtTFA进而调控线粒体亚基CO4和COX的活性，引起MMP的下降，进而导致MPT开放和细胞色素C的释放.

SO2和BaP刺激引起这些核转录因子下调的上游机制可能涉及到细胞因子的释放，如TNF-α和TGF-β，而细胞因子的释放进一步启动炎症反应通路，如 AMPK等.有报道指出，TNF-α可以通过降低体外培养的脂肪细胞及肌细胞的PGC-1α、NRF1和TFAM的mRNA水平而减少线粒体的生物合成［15］.在 A549细胞里，观察到TGF-β的诱导［16］能够降低PGC-1α及下游靶基因的 mRNA表达水平.而下游炎性通路中AMPK，ROS，Ca2+的活化，是激活PGC-1α的必要因素［17］.因此，推测SO2和BaP复合暴露可能通过诱导小鼠肺细胞因子的释放，启动炎症反应通路，通过NRF1-mtTFA调控途径来抑制线粒体的生物合成.其具体的上游调控机制还有待进一步的研究.

4　结论

4.1SO2和 BaP复合暴露可引起小鼠肺线粒体膜电位和细胞色素C氧化酶（COX）活性显著下降.

4.2SO2和BaP复合暴露，后肺线粒体COX亚基CO4mRNA水平显著降低，核转录因子NRF1 和mtTFA的mRNA和蛋白水平也显著下调.

4.3SO2和 BaP复合暴露可能通过诱导小鼠肺细胞因子的释放，启动炎症反应通路，通过NRF1-mtTFA调控途径来抑制线粒体的生物合成.

孟紫强，张 波，秦国华，等.二氧化硫对小鼠不同脏器DNA的损伤作用 ［J］. 中国环境科学， 2005，25（4）：424-427.

Meng Z Q， Liu Y X. Cell morphological ultrastructural changes in various organs from mice exposed by inhalation to sulfur dioxide ［J］. Inhalation Toxicology， 2007，19（6/7）：543-551.

Hadler H I， Cook G L. The mitochondrial activation of sulfate and arsenate and their role in carcinogenesis ［J］. Journal of Environmental Pathology and Toxicology， 1979，2（3）：601-612.

Zhang L J， Bao Y， Li J. Nuclear respiratory factor-1is involved in mitochondrial dysfunction induced by benzo（a）pyrene in humanbronchial epithelial cells ［J］. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology， 2011，109（2）：115-122.

Zhang L J， Bao Y， Liu Y， et al. Downregulation of nuclear respiratory factor-1contributes to mitochondrial events induced by benzo（a）pyrene ［J］. Environmental Toxicology， 2014，29（7）：780-787.

Meng Z Q， Qin G H， Zhang B. DNA damage in mice treated with sulfur dioxide by inhalation ［J］. Environmental and Molecular Mutagenesis， 2005，46：150-155.

Grova N， Schroeder H， Farinelle S， et al. Sub-acute administration of benzo［a］pyrene （B［a］P） reduces anxiety-related behaviour in adultmiceandmodulatesregionalexpressionof N-methyl-D-aspartate （NMDA） receptors genes in relevant brain regions ［J］. Chemosphere， 2008，73：S295-302.

Zoratti M， Szabò I. The mitochondrial permeability transition ［J］. Biochimica et Biophysica Acta.， 1995，1241（2）：139-176.

Eskandari M R， Mashayekhi V， Aslani M， et al. Toxicity of thallium on isolated rat liver mitochondria： The role of oxidative stress and MPTporeopening［J］.EnvironmentalToxicology，2015，30（2）：232-241.

Yang G， Jiang Y， Rao K， et al. Mitochondrial dysfunction and transactivation of p53-dependent apoptotic genes in BaP-treated human fetal lung fibroblasts ［J］. Human and Experimental Toxicology， 2011，30（12）：1904-1913.

Ko C B， Kim S J， Park C， et al. Benzo （a） pyrene-induced apoptotic death of mouse hepatoma Hepa1c1c7 cells via activation of intrinsic caspase cascade and mitochondrial dysfunction ［J］. Toxicology， 2004，199（1）：35-46.

Pauluhn J， Thyssen J， Althoff J， et al. Long-term inhalation study with benzo［a］pyrene and SO2in Syrian golden hamsters ［J］. Experimental Pathology， 1985，28（1）：31.

Green J L， Jones B C， Reed G A. Effects of sulfite on the uptake and binding of benzo［a］pyrene diol epoxide in cultured murine respiratory epithelial cells ［J］. Environmental Health Perspectives，1994，102（2）：216-220.

Reed G A， Jones B C. Enhancement of benzo［a］pyrene diol epoxide mutagenicity by sulfite in a mammalian test system ［J］. Carcinogenesis， 1996，17（5）：1063-1068.

Valerio A， Cardile A， Cozzi V， et al. TNF-α downregulates eNOS expression and mitochondrial biogenesis in fat and muscle of obese rodents ［J］. Journal of Clinical Investigation， 2006，116（10）：2791-2798.

Sohn E J， Kim J， Hwang Y， et al. TGF-β suppresses the expression of genes related to mitochondrial function in lung A549cells ［J］. Cellular and Molecular Biology （Noisy-le-Grand， France），2012，58：OL1763-1767.

Palikaras K， Tavernarakis N. Mitochondrial homeostasis： The interplay between mitophagy and mitochondrial biogenesis ［J］. Experimental Gerontology， 2014，56：182-188.

Molecular mechanism of co-exposure of sulfur dioxide and benzo（a）pyrene on mouse pulmonary cell mitochondriadamage.

QIN Guo-hua*， WU Mei-qiong， SANG Nan （College of Environmental Science and Resources， Shanxi University， Taiyuan 030006， China）.

China Environmental Science， 2015，35（11）：3496～3501

C57BL6 male mice were exposed to SO2（7mg/m3） for 28days， 6hours per day. In the first 5days of SO2inhalation， mice were injected intraperitoneally with BaP （40mg/kg b. w.）， which was dissolved in oil. The mitochondrial membrane potential （MMP） and activity of cytochrome C oxidase （COX） were detected by spectrophotometer. The mRNA levels of one subunit of COX （CO4） and three mitochondrial transcript factors （PGC1-α， NRF1， mtTFA） were analyzed by real-time RT-PCR after exposure. And the protein levels of the above three mitochondrial transcript factors were detected by Western blot. The results demonstrated that the co-exposure of SO2and BaP statistically reduced the MMP and activity of COX. The mRNA expression of CO4 was decreased after co-exposure of SO2and BaP， combined with the depressions of NRF1 and mtTFA mRNA and protein levels. It is indicated that conjunction of SO2and BaP regulated the expression of NRF1， which then inhibited the transcription and translation of related genomes and resulted in mitochondria damage in mouse lung.

SO2；BaP；mitochondria；cytochrome c oxidase；mitochondrial membrane potential；CO4；NRF1；mtTFA

X18，R994.6

A

1000-6923（2015）11-3496-06

2015-04-13

国家自然科学基金（21007036）；山西省自然科学基金（2012011036-6）；山西省高校优秀青年学术带头人支持计划（20120303）

* 责任作者， 教授， qinguojua@sxu.edu.cn

秦国华（1977-），女，山西潞城人，教授，博士，主要从事环境与健康方面的研究.发表论文40余篇.