IL- 25在小鼠哮喘中通过Nuocyte细胞诱导Th2炎性细胞因子的表达

刘清发，陈方方，刘 粉，李鸿佳，许文娟，孙启晶，宫 冰，张才擎*

(1.山东大学 医学院 附属千佛山医院 呼吸内科， 山东 济南 250014； 2.泰山医学院， 山东 泰安 271000；3.潍坊医学院， 山东 潍坊 261053)



研究论文

IL- 25在小鼠哮喘中通过Nuocyte细胞诱导Th2炎性细胞因子的表达

刘清发1，陈方方1，刘 粉1，李鸿佳1，许文娟2，孙启晶1，宫 冰3，张才擎1*

(1.山东大学 医学院 附属千佛山医院 呼吸内科， 山东 济南 250014； 2.泰山医学院， 山东 泰安 271000；3.潍坊医学院， 山东 潍坊 261053)

目的研究哮喘气道炎性因子IL- 25通过nuocyte细胞对Th2炎性细胞因子的影响。方法建立小鼠哮喘模型，分离并培养nuocyte细胞，将nuocyte细胞分为PBS对照组、IL- 25处理组、抗IL- 25组，体外给予IL- 25和抗IL- 25处理。ELISA方法检测细胞上清液IL- 5和IL- 13的含量；Western blot检测细胞IL- 5和IL- 13蛋白表达；RT-PCR检测IL- 5和IL- 13 mRNA表达；流式细胞计数测定nuocyte细胞数量。结果IL- 25处理组nuocyte细胞IL- 5及IL- 13在蛋白和基因水平的表达均比对照组和抗IL- 25组IL- 5及IL- 13表达水平高(P<0.05)；IL- 25处理组nuocyte细胞数量高于对照组及抗IL- 25组(P<0.05)。结论IL- 25在小鼠哮喘中可通过nuocyte细胞诱导IL- 5和IL- 13的表达，促进哮喘的发生和发展。

IL- 25；哮喘；nuocyte细胞；IL- 5；IL- 13

哮喘(asthma)使小气道痉挛和黏液大量分泌，引起气道狭窄和气道高反应。发病机制以Th1/Th2细胞比例失衡，激活CD4+TH2细胞释放IL- 5和IL- 13为主的Th2型免疫应答， 促使B细胞转换为IgE分泌型细胞[1]。固有免疫细胞也可生成IL- 5和IL- 13等TH2型细胞因子，在Th2型免疫应答的启动可能发挥着重要作用[2]。IL- 25刺激小鼠引起IL- 5和IL- 13等细胞因子升高，引发强烈的Th2型免疫应答[3]。

Nuocyte细胞是主要的固有免疫细胞之一，在细胞免疫应答中起重要作用，近年来发现 nuocyte细胞在细胞免疫应答中能促使TH2型细胞因子的表达。在哮喘动物实验中也发现大量的nuocyte细胞的存在，该细胞表面IL- 25受体高表达。IL- 25与nuocyte在哮喘中作用机制如何？本研究旨在探讨IL- 25和nuocyte对TH2型炎症因子表达的影响，为哮喘治疗提供新方向。

1 材料与方法

1.1材料

鸡清卵蛋白(OVA)(Sigma公司)；IL- 5抗体和IL- 13抗体(Abcam HongKong 公司)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)二抗(北京中杉金桥生物科技公司)；蛋白内参GAPDH(Ptglab公司)；GAPDH mRNA内参(康伟世纪公司)；ICOS-FITC和ST1/ST2-PE流式细胞术用兔抗小鼠抗体(BD公司)；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒和超敏ECL化学发光试剂盒(中国碧云天生物技术研究所)；Trizol总RNA提取试剂、SuperQuickRT cDNA第一链合成试剂盒(For Real-time PCR)和UltraSYBR Mixture(with ROX)(康为世纪公司)；RPMI-1640培养基和FCS(Gibco公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物:SPF级BALB/c雌性小鼠20只,6～8周，体质量15～25 g[山东大学医学院动物实验中心，动物合格证号：SCXR(鲁)20090001号]，随机双盲将动物分为对照组及哮喘组，每组为10只。哮喘模型制备参照HONDA[4]方法制作。1.2.2 肺功能检测:用5%的水合氯醛麻醉小鼠，气管切开，套管针置入、固定，将小鼠放入密闭的箱子中，连接管道，机械通气参数：呼吸频率为90次/min,潮气量5.6 mL/kg。呼吸压力为-8 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)，记录跨肺压、流速，潮气量容积的变化，用计算机计算用力最大流速(PEF)、FEV0.45/FVC时用5倍潮气量进行机械通气，-8 cmH2O负压辅助呼气，气道反应性以肺阻力(RL)表示。

1.2.3 标本处理:末次激发后24 h，解剖小鼠胸腔及腹腔，气管中注入0.3 mL的0.9%氯化钠溶液行肺泡灌洗3次，收集肺泡灌洗液离心，弃上清液，加入PBS、ICOS-FITC及ST1/ST2-PE抗体，流式细胞术测定nuocyte细胞数；取小鼠脾脏，分离nuocyte细胞，原代细胞培养；肺组织HE染色，显微镜下观察。

1.2.4 流式细胞测定nuocyte的数量:末次激发小鼠24 h之内，收集小鼠肺泡灌洗液，1 500 r/min，离心6 min，弃上清，沉淀中加入PBS重悬细胞，将流式抗体ICOS-FITC和ST1/ST2-PE加入重悬液中，4 ℃静置30 min，测定小鼠肺泡灌洗液中nuocyte细胞数，ICOS和ST1/ST2双阳性细胞为nuocyte细胞。

1.2.5 Nuocyte细胞分离、分组及处理:用水合氯醛麻醉后，无菌条件下取出小鼠脾脏，用RPMI-1640反复冲洗脾组织，用研钵将脾脏研磨碎，收集液体，后加入含淋巴分离液的无菌离心管中，2 000 r/min，离心15 min，吸取单个核细胞层接种于培养瓶中，加入RPMI-1640培养基，37 ℃，5% CO2恒温箱中培养细胞。24 h更换培养液。细胞贴壁增殖到90%以上时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，均匀将细胞接种于培养瓶中，按时换液体。待细胞传代及增殖状态较好时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，制成单细胞悬液并计数，取1×106个细胞，用抗ICOS-FITC和ST1/ST2-PE抗体，避光孵育30 min，流式细胞实验分析nuocyte细胞表面标志，ICOS和ST1/ST2双阳性细胞为nuocyte细胞。将nuocyte细胞分组并进行培养，以1×105/mL个细胞密度分别种植于6孔板中，每孔2.5 mL，加入含20%FCS的RPMI-1640培养基于37 ℃，5%的CO2培养箱中孵育24 h。实验分为PBS对照组、IL- 25处理组(50 μg/L)、抗IL- 25组(50 μg/L)。保留细胞培养上清液，用ELISA、Western blot及RT-PCR方法，检测IL- 5和IL- 13蛋白及基因的表达，每个组设置3个复孔，独立实验重复3次。

1.2.6 ELISA方法检测:Nuocyte细胞在温箱中孵育24 h，收集培养液于1.5 mL离心管中，2 500 r/min，离心3 min，收集上清液，按ELISA试剂盒说明书操作，依次加入收集的上清液、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗、底物及终止液等，测定细胞培养液中IL- 5及IL- 13含量。

1.2.7 Western blot检测nuocyte 中IL- 5及IL- 13的表达:将细胞37 ℃温箱孵育24 h，胰蛋白酶消化细胞后，1 500 r/min，离心5 min，弃上清液，细胞沉淀中加50 μL细胞裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)，冰上裂解10 min，4 ℃，12 000 r/min，离心15 min。收集上清液，BCA试剂盒测定蛋白浓度。配制12%分离胶和5%浓缩胶进行蛋白电泳、凝胶上蛋白转到0.22 μm 的PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭，IL- 5及IL- 13抗体、内参(山羊抗兔GAPDH抗体)(1∶3 500)4 ℃孵育过夜，TBST清洗，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗(1∶6000)37 ℃孵育1 h，TBST清洗，ECL发光试剂盒显影。

1.2.8 RT-PCR检测IL- 5及IL- 13 mRNA在不同nuocyte细胞组中的表达:RPMI-1640培养基培养nuocyte细胞，按照Trizol试剂盒的步骤提取细胞总RNA。紫外分光光度计检测mRNA纯度及浓度。cDNA合成按照反转录试剂盒说明书操作；再按照DNA扩增试剂盒的说明分别加入IL- 5及IL- 13引物(表1)和反转录的cDNA，反应体系20 μL，ABI7900RT-PCR扩增仪95 ℃ 15 min，95 ℃ 10 s，65 ℃ 32 s进行40个循环扩增，以GAPDH mRNA(小鼠的GAPDH引物)为内参，根据2-△△CT公式计算IL- 5 mRNA及IL- 13 mRNA的表达量。

表1 扩增基因引物序列Table 1 Primer sequences used for amplification gene

1.9 统计学分析

3 结果

2.1 小鼠造模成功的评估

2.1.1 小鼠哮喘症状:OVA诱导组小鼠出现全身毛发竖立，易激惹，性情暴躁不安，呼吸频率急促，腹肌抽动甚至出现点头呼吸等症状。

2.1.2 小鼠肺组织病理学改变:对照组小鼠气道黏膜正常，肺泡壁结构完整，无黏液分泌，无炎性细胞浸润；哮喘组小鼠气道黏膜充血水肿，肺泡壁结构残缺，有大量黏液分泌，支气管壁及血管周围有大量炎性细胞浸润(图1)。

2.1.3 肺功能变化及RL的变化:OVA小鼠组反应气道高反应性的肺阻力RL明显升高(P<0.05)；OVA组肺功能指标PEF、FEV0.4/FVC均高于对照组(P<0.05) (图2)。

2.2 流式细胞测定nuocyte的数量

与对照组(图3A)相比较，哮喘组(图3B)小鼠肺泡灌洗液中nuocyte细胞数量为(2 890±432)明显增高于对照组(832±65)(P<0.05)。

2.3 ELISA检测nuocyte细胞中IL- 5及IL- 13的浓度

与对照组比较，IL- 25处理组nuocyte细胞中分泌的IL- 5及IL- 13均明显升高(P<0.05)(图4)。

2.4 Western blot检测nuocyte中IL- 5和IL- 13的表达

与对照组比较，IL- 25处理组nuocyte细胞中分泌的IL- 5和IL- 13均明显升高(P<0.05)(图5和表2)。

A.control; B.asthma图1 小鼠肺组织HE染色Fig 1 Hematoxylin-eosin staining of mouse lung tissues (HE×200)

A.pulmonary function of PEF; B.pulmonary function of FEV0.4/FVC; C.airway hyperresponsiveness;#P<0.05 compared with control

A.the number of nuocyte in control； B.the number of nuocyte in asthma; Q1.ST1/ST2 Single positive； Q2.ST1/ST2 and ICOS double positive； Q3.ST1/ST2 and ICOS double negative； Q4.ICOS single positive

图3 流式细胞术检测小鼠肺泡灌洗液中nuocyte的数量
Fig 3 The number of nuocyte detection in mouse alveolar lavage fluid by flow cytometry

2.5 RT-PCR测定结果

与对照组相比，IL- 25处理组nuocyte细胞中IL- 5 mRNA及IL- 13 mRNA表达均明显升高(P<0.05)(图6)。

*P<0.05 compared with control group图4 ELISA检测nuocyte细胞中IL- 5及IL- 13的浓度Fig 4 The expresstion of IL- 5 and IL- 13 in nuocyte detected by ELISA(±s, n=10)

图5 Western blot 检测nuocyte细胞中IL- 5和IL- 13蛋白表达Fig 5 The expresstion of IL- 5 and IL- 13 in nuocytedetected by Western blot (±s, n=3)

groupIL-5IL-13control1.001.00 anti-IL-250.92±0.230.89±0.25IL-251.98±0.47*1.64±0.52*

*P<0.05 compared with control group.

*P<0.05 compared with control group图6 RT-PCR检测nuocyte细胞中IL- 5mRNA及IL- 13 mRNA的表达Fig 6 The expresstion of IL- 5mRNA and IL- 13 mRNAin nuocyte detected by RT-PCR(±s, n=3)

3 讨论

哮喘反应核心是TH2型炎症因子介导的免疫应答。研究表明，固有免疫细胞nuocyte及IL- 25均参与TH2型免疫应答[5- 6]。IL- 25可在肺、上皮细胞[5- 7]，Th2细胞[5]等表达，与受体IL- 17BR结合介导生物学效应。IL- 25引起哮喘的作用已有报道[8- 10]。nuocyte细胞在免疫反应中的作用虽还不明确，但在启动某些疾病Th2型免疫应答中发挥重要作用[2]。本实验通过观察nuocyte细胞及IL- 25对TH2型细胞因子的影响，结果显示IL- 25通过nuocyte细胞促进TH2型细胞因子表达。

本文对造模小鼠肺功能及肺组织进行病理学检测，证实了哮喘造模的成功。流式细胞术检测肺泡灌洗液中nuocyte细胞数，发现哮喘组中明显增多。有文献研究报道，在寄生虫感染和过敏性肺部炎症引起的Th2型免疫应答中，也发现了大量nuocyte细胞产生[11]，提示其可能参与哮喘的发生过程。然而具体机制还有待阐明。

本研究将IL- 25和抗IL- 25抗体分别加入nuocyte细胞中进行干预，发现IL- 25组大量分泌IL- 5和IL- 13细胞因子，比其他组明显增高；并且IL- 25组IL- 5和IL- 13mRNA的表达也较另两组明显上调，与Min B等研究相符[12]，IL- 25是Th2型免疫应答的强效激活剂[13]，其作用于nuocyte细胞后产生大量IL- 5和IL- 13细胞因子[6]，表明IL- 25能促进TH2炎症细胞因子表达，可能机制与以下因素有关：1)IL- 25和nuocyte细胞参与了哮喘的发生发展，nuocyte细胞表面有ICOS、T1/ST2及IL- 17BR受体表达[11]，而IL- 25可能与其表面IL- 17BR受体结合，促使nuocyte分泌IL- 5及IL- 13等细胞因子，加重哮喘疾病进展。2)IL- 25与nuocyte细胞表面的IL- 17BR结合，使nuocyte细胞增生[13],可能促使本身分泌大量IL- 5及IL- 13等细胞因子，但具体机制尚不明确，有待进一步探讨。

总之，IL- 25可能通过nuocyte细胞促进IL- 5和IL- 13等TH2型细胞因子的表达，诱发哮喘的发生发展，在哮喘研究和治疗方面提供新的方向和治疗靶点，然而IL- 25与nuocyte之间的确切作用机制及在哮喘中发挥的具体作用还有待进一步研究。

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IL- 25 induces expression of Th2inflammatory factor by nuocyte in asthma of mouse

LIU Qing-fa1, CHEN Fang-fang1, LIU Fen1, LI Hong-jia1, XU Wen-juan2, SUN Qi-jing1,GONG Bing3, ZHANG Cai-qing1*

(1.Dept. of Respiratory，Qianfoshan Hospital，Shandong University，Jinan 250014； 2.Taishan Medical College，Taian 271000； 3.Weifang Medical College，Weifang 261053，China)

Objective To study the effect of Interleukin- 25 on expressing Th2 inflammatory factor in mouse asthma by nuocyte cells. Methods Nuocytes were collected from mouse spleen of OVA-induced asthma model by density gradient centrifugation. Samples were divided into 3 groups according to different intervention conditions: Interleukin-25 group; control group; anti-Interleukin- 25 group. The expression of Interleukin- 5 and Interleukin- 13 proteins in nuocyte cells supernatant was detected by ELISA. The expression of Interleukin- 5 and Interleukin- 13 in nuocyte cells was detected by Western blot. The expression of Interleukin- 5 and Interleukin- 13 mRNA was detected by RT-PCR. The number of nuocyte cells was detected by flow cytometry. Results The expression of Interleukin- 5 and Interleukin- 13 protein and related gene in Interleukin- 25 group was higer than that in the control group or anti-Interleukin- 25 group (P<0.05). The number of nuocyte cells in Interleukin- 25 group was more than that in control group or anti-interleukin- 25(P<0.05). Conclusions Interleukin- 25 can promote the expressing Interleukin- 5 and Interleukin- 13 in asthma by nuocyte cells and promote the occurrence and development of asthma.

interleukin- 25；asthma；nuocyte；interleukin- 5；interleukin- 13

2015- 02- 01

2015- 07- 01

山东省科技攻关基金(2012ZSF11830)

1001-6325(2015)11-1508-06

R562.25

A

*通信作者(corresponding author)：freezcq66@163.com