地黄酒炖过程化学成分及“味”的关系

钟 恋， 汪云伟， 杨诗龙， 黎 量， 刘玉杰， 黄勤挽

(成都中医药大学，四川成都611137)

地黄为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的新鲜或干燥块根。生地黄性甘、寒，功效以清热凉血、养阴生津为主;熟地黄性甘、温，功效以补血滋阴、填精益髓为主［1］。地黄经酒炖炮制，化学成分发生改变［2-4］，其“味”也发生一定的变化。文献 ［5］指出，中药的“味”和它本身的化学成分具有密切关系，而近年来发展起来的电子舌技术是一种分析、识别液体“味”的新型检测手段［6］。因此，本实验采用HPLC法测定地黄酒炖过程中梓醇、毛蕊花糖苷及5-羟甲基糠醛 (5-HMF)的含有量变化，分析地黄酒炖过程化学成分的变化规律;同时采用电子舌技术采集地黄酒炖炮制过程“味”的电子舌响应值，应用统计质量分析 (SQC)模型分析其“味”的变化规律;最后对“味”的电子舌响应与化学成分的相关性进行探索。

1 仪器与试药

岛津LC-2010A自动高效液相色谱仪 (包括四元泵、单波长检测器、柱温箱、自动进样器、LC-solution色谱工作站)，ASTREE电子舌 (法国Alpha.MOS公司)，BP 211D电子天平 (德国赛多利斯股份有限公司)，优普超纯水制造系统 (四川优普超纯科技有限公司)，恒温水浴锅，超声波仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)，色谱甲醇、色谱乙腈 (美国Fisher公司)，黄酒 (浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司)，磷酸、冰醋酸均为分析纯。梓醇对照品、毛蕊花糖苷对照品、5-HMF对照品购于成都曼斯特生物科技有限公司，批号分别为 MUST-13030609、 MUST-13122711、 MUST-13110805。生地黄购于河南省焦作市武陟县，由成都中医药大学卢先明教授鉴定为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的干燥块根。

2 方法与结果

2.1 炮制品制备 取大小均匀生地黄4 kg，清水淘洗3次除去泥沙，加黄酒1.6 kg润透后置于陶瓷锅内，密闭后隔水炖制24 h，在0、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、24 h 分别取样200 g，编号，样品置于40℃烘箱干燥12 h，备用。

2.2 化学成分定量测定

2.2.1 色谱条件 Global chromatography C18色谱柱 (250 mm ×4.6 mm，5μm)，测定梓醇流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液 (1∶99)，检测波长210 nm;测定毛蕊花糖苷流动相为乙腈-0.1%醋酸溶液 (16∶84)，检测波长 334 nm［1］;测定5-HMF流动相为甲醇-水 (5∶95)，检测波长284 nm。体积流量1 mL/min，柱温30℃。

2.2.2 对照品溶液制备 取梓醇、毛蕊花糖苷、5-HMF对照品适量，分别加乙腈-0.1%磷酸溶液(1∶99)、乙腈-0.1%醋酸溶液 (16∶84)、甲醇制备成0.215、0.0313、0.0768 mg/mL的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液制备 参考《中国药典》2010年版一部地黄项下［含量测定］样品处理方法进行供试品制备［1］，得测定梓醇供试品溶液 (供试品溶液1)和测定毛蕊花糖苷的供试品溶液 (供试品溶液2)。另取地黄样品粗粉，精密称取约1.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入20%甲醇25 mL，超声提取30 min，摇匀，过滤，取滤液0.45 μm微孔滤膜滤过，得测定5-HMF的供试品溶液 (供试品溶液3)。

2.2.4 线性关系考察 精密取0.384 mg/mL的5-HMF对照品溶液，加甲醇分别稀释成0.0768、0.0384、0.00768 mg/mL的对照品溶液，结果5-HMF进样量在0.015～0.768 μg范围内与峰面积呈良好线性关系 (线性方程:y=4.31×106x+5128.79，r=0.9998)。

2.2.5 稳定性试验 取同一地黄样品，按“2.2.3”项所述供试品溶液3制备方法制备，分别在配制后0、4、8、12、16、20、24 h进样10 μL，结果5-HMF峰面积积分值RSD为2.5%，表明样品在24 h内稳定。

2.2.6 精密度试验 精密吸取供试品溶液3，按上述色谱条件，重复进样6次，结果5-HMF峰面积积分值RSD为1.3%，表明仪器精密度良好。

2.2.7 重复性试验 取同一地黄样品粉末6份，分别制备供试品溶液，注入液相色谱仪，在上述色谱条件下测定峰面积，用外标两点法计算。结果5-HMF平均含有量为0.067%，RSD为1.8%，表明测定5-HMF方法重复性良好。

2.2.8 回收率试验 采用加样回收法，称取已知含有量的地黄样品 (JD S13)6份，每份1.0 g，精密称定，分别加入0.213 mg/mL的5-HMF对照品溶液3 mL，超声处理30 min，同上测定，计算5-HMF的回收率，结果见表1。

表1 5-HMF加样回收率试验结果Tab.1 Results of recovery tests for 5-HMF

2.2.9 样品测定 精密吸取梓醇对照品溶液、5-HMF对照品溶液、供试品溶液1、供试品溶液3各10 μL及毛蕊花糖苷对照品溶液、供试品溶液220 μL，注入液相色谱仪中，梓醇、毛蕊花糖苷按外标一点法计算，5-HMF按外标二点法计算，以干燥品计，结果见表2。

2.3 电子舌技术“味”动态变化分析

2.3.1 样品处理 取地黄样品粗粉，精密称定1.0 g，加水100 mL，超声提取30 min，过滤，取滤液50 mL加水定容至100 mL，备用。

表2 样品测定结果 (n=3)Tab.2 Determination of samples(n=3)

2.3.2 分析方法 采集温度25℃，数据采集时间120 s，采集周期1 s，搅动速度1 r/s。以超纯水为清洗液，每次测量样品前清洗传感器10 s。将配制好的样品溶液置于100 mL专用烧杯中，进行电子舌测定。每份样品平行测定10次，取其中最后3次稳定可靠数据作为输出值进行后期分析处理。

2.3.3 精密度考察 电子舌由 ZZ、AB、BB、CA、GA、DA、JE7个传感器进行数据采集，以100～120 s内传感器平均响应值作为输出值。采用“2.3.1”项及“2.3.2”项所述分析方法采集数据，进行精密度考察。重复测定同一样品10次，取其中最后3次数据作为输出值。数据精密度结果如表3，结果显示各传感器输出值 RSD均小于3%，数据结果稳定，仪器精密度良好。

表3 电子舌精密度考察结果Tab.3 Inspection results of precision in electronic tongue

2.3.4 统计质量分析 (SQC) SQC是在考虑样本的差异性的基础上，通过计算参考样本得出接受区域和拒绝区域。未知样本被映射到图表中，得出结论接受或拒绝。对每个数据点而言它在单元内的距离表明了差异［7］。

将地黄酒炖炮制过程共14个样品的电子舌传感器响应值进行SQC分析，以未炖样品 (JD S0)样品为参照样本建立SQC模型，将其他样品与其进行比较，结果如图1。

图1 地黄酒炖炮制过程样品SQC分析图Fig.1 SQC analysis chart of stewing Rehmanniae Radix with wine

由图1可见，地黄未炖样品 (JD S0)与其他酒炖样品“味”的电子舌传感器响应值差异较大，表明未炖样品与酒炖样品之间“味”差异明显，可以通过电子舌实现区分。随着炮制程度加重，样品“味”电子舌传感器响应值呈现明显变化趋势，未炖样品与酒炖样品的差异越来越大。JD S13至JD S24“味”的电子舌传感器响应值变化较大，表明地黄在酒炖的13 h后的阶段“味”的变化较明显。

2.4 相关性探索 相关性分析通过运用SPSS 17.0软件对电子舌测定的7个传感器响应值进行主成分抽取降维［8］，得第一主成分得分FAC1和第二主成分得分 FAC2，其贡献率分别为 55.579%和37.268%，累计贡献率达92.847%，因此可认为FAC1和FAC2能够代表样品的电子舌响应值特征。将FAC1、FAC2与梓醇、毛蕊花糖苷、5-HMF的量运用SPSS 17.0软件进行相关性分析，由于各变量均不服从正态分布，因此采用斯皮尔曼相关系数，分析结果如表4。

从表4可以看出，FAC2与梓醇、毛蕊花糖和5-HMF均有显著的相关性 (P＜0.01)，其中与梓醇的相关系数达0.95以上;FAC1与以上化学成分的相关性不显著。

表4 地黄样品测定数据相关性系数分析结果Tab.4 Measurement data correlation coefficient analysis results of samples

3 结论与讨论

在进行5-HMF定量测定时，对不同比例的甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸及乙腈-0.1%磷酸流动相进行考察，结果表明以甲醇-水 (5∶95)为流动相时，5-HMF色谱峰分离效果好，色谱重复性好。对提取溶剂进行了考察，分别选择甲醇，50%甲醇，20%甲醇和水作为提取溶剂，结果20%甲醇能更为有效地提取样品中的5-HMF。

随着酒炖程度加重，地黄中梓醇含有量明显下降。梓醇为环烯醚萜葡萄糖苷，在加工过程中容易发生苷键断裂脱去糖基而降解［9］，这可能是其含有量随炮制程度加重而明显下降的原因。毛蕊花糖苷随酒炖程度加重含有量也呈明显下降，而其在地黄加工炮制过程发生何种变化目前还未见报道，有待进一步研究。根据实验结果，5-HMF含有量则随炮制程度加重呈上升趋势，酒炖11 h后含有量上升明显。5-HMF是具有代表性的美拉德反应中间产物，也用于判断是否发生了美拉德反应［10］，其主要存在于可能发生糖降解反应和美拉德反应的食品和植物中［11］。地黄酒炖过程5-HMF大量产生，因此推断糖降解反应和美拉德反应可能是地黄酒炖炮制机理之一。

电子舌技术检测酒炖过程地黄性状“味”的特征，实现对“味”的客观化。随着炮制程度加重，各样品“味”的电子舌响应值变化趋势呈现规律，能体现出酒炖前后的差异，因此电子舌技术结合SQC分析方法可以实现地黄酒炖炮制过程的质量监控。同时笔者对样品“味”的电子舌响应值与梓醇、毛蕊花糖苷、5-HMF含有量变化的相关性进行了探索研究，结果显示电子舌响应值降维后的FAC2与梓醇、毛蕊花糖苷和5-HMF的含有量变化均有显著相关性，FAC1与3种化学成分含有量变化没有显著相关性，但FAC2贡献率仅有37.268%，因此认为梓醇、毛蕊花糖苷和5-HMF3种成分的含有量变化与“味”电子舌响应值变化虽然具有一定的相关性，但引起地黄炮制“味”变化的主要物质可能还有其他化学成分，将进行进一步研究。

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