不同微量元素对斑玉蕈菌丝生长及酶活的影响

孙淑静 ,单书凯 ,李钊锋 ,郭艳艳 ,陈文星 ,胡开辉

(福建农林大学生命科学学院 ,福建福州350002)

不同微量元素对斑玉蕈菌丝生长及酶活的影响

孙淑静 ,单书凯 ,李钊锋 ,郭艳艳 ,陈文星 ,胡开辉

(福建农林大学生命科学学院 ,福建福州350002)

低脂肪、低热量的珍稀名贵食用菌[13].但斑玉蕈在生产过程中生产周期较长(120－150 d) ,菌体生长速度慢 ,原料利用率低 ,从而增加了生产成本 ,影响了生产企业的效益[14－15].本研究通过探索微量元素对斑玉蕈新品种闽真1号在不同培养基质中菌丝生长和基质利用相关酶酶活的影响 ,为斑玉蕈实验室菌丝培养及通过微量元素调节菌丝生长速度、提高基质降解效率方面的研究提供依据.

通过在PDA加富培养基和生产培养基中添加6种微量元素 ,探索不同条件下微量元素对斑玉蕈菌丝生长及基质降解有关酶的酶活的影响.结果表明:PDA加富培养基中添加100、60、500、100 mgűL－1的微量元素Mn2＋、Ca2＋、Mo6＋、Fe2＋,显著促进菌丝生长；生产培养基中添加100 mgűkg－1的Fe2＋和Cu2＋对菌丝生长有明显的促进作用 ,添加100 mgűkg－1Zn2＋对菌丝生长有抑制作用；生产培养基中添加100 mgűkg－1的Cu2＋显著提高漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶的酶活 ,其酶活分别达到39.83、19.17和9.58 UűmL－1.表明每种微量元素对纤维素酶和木聚糖酶酶活的影响不显著 ,在不同培养基中不同微量元素对斑玉蕈的菌丝生长及酶活的影响不同.

斑玉蕈；微量元素；菌丝生长速度；酶活

近年来 ,利用深层培养的真菌菌丝体来富集和转化微量元素方面的研究引起人们关注[1－2],但微量元素对食用菌菌丝及酶活的影响的研究相对较少.微量元素对食用菌菌丝的生长速度和子实体的分化、发育、产量与品质方面有重要影响[3－4].微量元素还是某些酶的必要因子 ,食用菌木质素降解酶系高效降解食用菌培养基中的木质素 ,为食用菌菌体的生长提供营养 ,促进菌体和子实体的生长发育[5－7].同时酶活的高低可以衡量菌丝的代谢能力[8],从而反映菌株对基质的降解能力 ,影响食用菌的生产周期.因此 ,探索微量元素对食用菌菌丝生长、木质素降解酶系酶活的影响 ,对提高基质木质素的降解率、缩短食用菌生产周期、提高生物学效率具有重要意义.已有微量元素对平菇[9]、金针菇[10]、猴头菌[11]等生长发育的影响的相关研究报道.郭艳艳等[12]对不同营养条件下斑玉蕈的菌丝生长及与基质利用相关的酶的产酶特性进行了研究.但微量元素对斑玉蕈在不同培养基质中菌丝生长发育及基质利用相关酶酶活影响的研究尚未见报道.

斑玉蕈Hypsizygus marmoreus(Peck)H.E.Bigelow又名玉蕈 ,属伞菌目口蘑科玉蕈属 ,是一种高蛋白、

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 斑玉蕈闽真1号 ,由福建农林大学微生物工程实验室提供.

1.1.2 培养基 PDA加富培养基包括200 gűL－1马铃薯、20 gűL－1葡萄糖、3 gűL－1酵母粉、3 gűL－1蛋白胨、1.5 gűL－1KH2PO4、1.5 gűL－1MgSO4ű7H2O、20 gűL－1琼脂 ,pH自然；生产培养基包括71%棉籽壳、23%麦麸、5%玉米粉、1%生石灰 ,含水量65%.

1.2 方法

1.2.1 试验设计 向PDA加富培养基中分别添加10 gűL－1的MnSO4űH2O、无水CaCl2、Na2MoO4ű 2H2O、ZnCl2、FeSO4ű7H2O、CuSO4ű5H2O溶液 ,使其在PDA加富培养基中终浓度分别为20、60、100、500 mgűL－1,即每种微量元素设置4个浓度梯度.

向生产培养基中分别添加MnSO4űH2O、无水CaCl2、Na2MoO4ű2H2O、ZnCl2、FeSO4ű7H2O、CuSO4ű 5H2O ,使其在生产培养基中的终浓度为100 mgűkg－1.以不添加以上物质为对照 ,每个处理设3个重复.

1.2.2 菌株生长速度的测定 将待测菌株分别接种于PDA加富培养基、含Mn2＋、Ca2＋、Mo6＋、Zn2＋、Fe2＋、Cu2＋微量元素的培养基平板上 ,每种培养基做3个重复 ,置于24℃恒温培养箱中培养.从第3天起每隔1 d测其菌丝生长速度.将待测菌株分别接种于生产培养基及含Mn2＋、Ca2＋、Mo6＋、Zn2＋、Fe2＋、Cu2＋微量元素的培养基试管中 ,每种培养基做3个重复 ,置于24℃恒温培养箱中培养 ,从第10天起每隔10 d测其菌丝生长速度.

1.2.3 粗酶液的提取 分别将接种前以及菌丝长10、20、30、40 d时试管中的栽培料全部取出(接种前试管栽培料为32 g) ,在粉碎机里将其粉碎 ,混匀后 ,称取10 g置250 mL三角瓶中 ,然后加入50 mL无菌水 ,置于24℃、110 rűmin－1的摇床中浸提2 h ,过滤离心 ,取其上清液 ,即为粗酶液.

1.2.4 漆酶活性的测定 参照吴涓等[16]的方法 ,取2.7 mL HAc-NaAc缓冲液(pH＝4.5)、0.1 mL 1 mmolű L－1ABTS溶液、0.2 mL粗酶液 ,在30℃下 ,测定反应开始前3 min的D420nm增量.设3个重复 ,以灭活15 min的粗酶液作为空白对照.

1.2.5 锰过氧化物酶酶活的测定 参照周金燕等[17]的方法 ,取1.5 mL酶液 ,含有终浓度为0.4 mmolűL－1的愈创木酚、0.1 mmolűL－1的H2O2、0.2 mmolűL－1的MnSO4及50 mmolűL－1的琥珀酸钠缓冲体系(pH＝4. 5) ,以0.1 mmolűL－1的H2O2启动反应.在40℃下 ,测定反应开始前3 min的D465nm增量.设3个重复 ,以灭活15 min的粗酶液作为空白对照.

1.2.6 木质素过氧化物酶酶活的测定 参照荚荣等[18]的方法 ,取1.5 mL 0.2 molűL－1酒石酸钠缓冲液(pH＝3.0)、1.0 mL15 mmolűL－1藜芦醇、0.6 mL酶液 ,以0.1 mL 15 mmolűL－1H2O2启动反应.在40℃下 ,测定反应开始前1 min的D310nm的增量.设3个重复 ,以去离子水作为空白对照.

1.2.7 纤维素酶酶活的测定 参照赵玉萍等[19]的方法 ,在具塞试管中加入(50±1)mg滤纸、1 mL酶液和1 mL 100 mmolűL－1HAc-NaAc缓冲液(pH＝4.6) ,置于50℃恒温水浴锅中保温1 h ,取出后立即加入3 mL DNS溶液 ,沸水显色5 min ,冷却至室温 ,加蒸馏水定容至25 mL ,测D520nm值.设3个重复 ,以灭活15 min的粗酶液作为空白对照.

1.2.8 木聚糖酶酶活的测定 参照刘苹等[20]的方法 ,在具塞试管中加入1.5 mL 1%(体积分数)木聚糖溶液、0.5 mL酶液 ,置于50℃恒温水浴锅中保温20 min ,取出后立即加入3 mL DNS溶液 ,沸水显色5 min ,冷却至室温 ,加蒸馏水定容至10 mL ,测D550nm值.设3个重复 ,以灭活15 min的粗酶液作为空白对照.

1.2.9 数据处理 数据统计分析采用DPS 7.05数据处理软件 ,采用单因素方差分析法进行差异显著性检验.

2 结果与分析

2.1 不同微量元素对菌丝生长的影响

2.1.1 PDA加富培养基平板上菌丝的生长速度 由图1、2可知 ,在PDA加富培养基平板上 ,不同微量元素对闽真1号菌丝生长的影响不同 ,同一微量元素在不同浓度下对闽真1号菌丝生长的影响也不同. Mn2＋、Ca2＋、Mo6＋、Fe2＋对菌丝的生长有促进作用 ,其添加量分别为100、60、500、100 mgűL－1时 ,菌丝直径分别为7.18、7.15、7.28、7.13 cm ,与对照(6.92 cm)相比差异显著；Cu2＋对菌丝生长有明显的抑制作用 ,当其质量浓度为20 mgűL－1时 ,菌丝直径为5.74 cm ,与对照(6.92 cm)相比差异极显著；Zn2＋对菌丝生长影响不大 ,只有当其质量浓度为500 mgűL－1时对菌丝生长有显著的抑制作用.

图1 添加不同微量元素的PDA加富培养基平板上菌丝直径Fig.1 The mycelia diameter on enriched PDA media with different concentration and different trace elements

图2 添加不同微量元素的PDA加富培养基平板上菌丝的生长速度Fig.2 The mycelia growth rates on enriched PDA media with different trace elements

2.1.2 生产培养基中菌丝的生长速度 在生产培养基中添加100 mgűkg－1不同金属离子 ,由表1和图3可知:在第36天 ,Mn2＋、Fe2＋、Cu2＋对菌丝生长有显著的促进作用 ,Zn2＋对菌丝生长有抑制作用 ,在添加30和36 d后 ,菌丝高度分别为4.93、6.70 cm ,与对照(6.82、8.33 cm)相比 ,差异显著；而Ca2＋、Mo6＋对菌丝生长的影响不显著.表明在PDA加富培养基上添加不同微量元素对闽真1号菌丝生长的影响是不同的 ,特别是Cu2＋对不同营养条件下菌丝生长速度影响的差异性较大.

表1 添加不同微量元素的生产培养基中菌丝高度1)Table 1 The mycelia height in production media with different trace elementscm

2.2 不同微量元素对酶活的影响

2.2.1 不同微量元素对漆酶酶活的影响 生产培养基中 ,在菌丝生长起始阶段检测不到漆酶；当菌丝长至第30天时 ,添加Mn2＋、Ca2＋、Mo6＋、Fe2＋、Cu2＋的生产培养基中可以检测到漆酶 ,但酶活较低；当菌丝生长40 d后 ,漆酶酶活增大；添加Mn2＋和Fe2＋后漆酶酶活分别为18.67和19.68 UűL－1,与对照(17.00 UűL－1)相比差异显著(P<0.05).添加Ca2＋、Mo6＋和Zn2＋抑制漆酶酶活 ,漆酶酶活分别为1.25、2.42和1.00 UűL－1,与对照(17.00 UűL－1)相比差异显著(P<0.05).添加Cu2＋的生产培养基中 ,漆酶酶活最高 ,为39.83 UűL－1,是对照的2.34倍.由此可知 ,100 mgűkg－1的Cu2＋对漆酶的分泌有促进作用 ,是漆酶的一个激活剂.

2.2.2 不同微量元素对锰过氧化物酶活酶活的影响

由图4可看出 ,在菌丝生长初期检测不到锰过氧化物酶；当菌丝长至第20天时 ,可以检测到锰过氧化物酶 ,各金属离子对锰过氧化物酶酶活没有显著性影响；随着培养时间的增加 ,锰过氧化物酶酶活逐渐增大.但在整个菌丝生长过程中 ,锰过氧化物酶酶活都比较低 ,与对照相比 ,在第40天添加Cu2＋对锰过氧化物酶酶活有显著的促进作用；而Mn2＋、Ca2＋、Mo6＋、Zn2＋对锰过氧化物酶酶活有显著的抑制作用.

2.2.3 不同微量元素对木质素过氧化物酶酶活的影响 随着菌丝培养时间的增加 ,木质素过氧化物酶酶活先逐渐升高 ,随后降低.在整个生长阶段 ,木质素过氧化物酶的活性都不高 ,在菌丝生长至第30天时 ,酶活达到最大.添加Cu2＋的培养基中木质素过氧化物酶的活性最高 ,达9.58 UűmL－1,与对照(6.77 UűmL－1)相比差异显著 ,结果见图5.

2.2.4 不同微量元素对纤维素酶酶活的影响 由图6可看出 ,在整个菌丝生长阶段 ,随着培养时间的增加 ,纤维素酶酶活逐渐增大.与对照相比 ,添加Mn2＋、Ca2＋、Mo6＋对菌丝生长后期纤维素酶酶活有明显的抑制作用；而添加Zn2＋、Fe2＋、Cu2＋对纤维素酶酶活有轻微的促进作用 ,差异不显著.

2.2.5 不同微量元素对木聚糖酶酶活的影响 在整个菌丝生长阶段 ,随着培养时间的增加 ,木聚糖酶酶活逐渐增大；但在菌丝生长后期 ,酶活会稍微降低 ,各种微量元素对木聚糖酶酶活影响不大.添加Zn2＋、Fe2＋对木聚糖酶活性有显著的抑制作用 ,结果见图7.在整个菌丝生长阶段 ,木聚糖酶酶活比其他酶酶活大 ,表明木聚糖酶对菌丝后期的生长起着非常重要的作用.

图3 添加不同微量元素的生产培养基中菌丝生长速度Fig.3 The mycelia growth rate in production media with different trace elements

图4 不同微量元素对锰过氧化物酶酶活的影响Fig.4 Effect of different trace elements on the activities of manganese peroxidase

图5 不同微量元素对木质素过氧化物酶酶活的影响Fig.5 Effect of different trace elements on the activities of lignin peroxidase

图6 不同微量元素对纤维素酶酶活的影响Fig.6 Effect of different trace elements on the activities of cellulase

3 讨论

不同微量元素及同一微量元素在不同浓度下对斑玉蕈的菌丝生长和酶活的影响程度各不相同.PDA加富培养基中添加Zn2＋对菌丝生长影响不大 ,根据王宜磊[21]的报道 ,这有可能是Cl－的影响 ,而选用Zn-SO4会促进平菇菌丝生长.在生产培养基中添加Zn2＋,对菌丝生长有明显的抑制作用 ,这可能是由于所添加的Zn2＋的浓度偏高 ,根据王晓光[22]的报道 ,低浓度的Zn2＋对菌丝体的生长有促进作用 ,但高浓度的Zn2＋对菌丝体的生长有抑制作用.在PDA加富培养基中添加Cu2＋对菌丝生长有明显的抑制作用 ,而在生产培养基中添加Cu2＋对菌丝生长却有显著的促进作用 ,可能是由于在PDA加富培养基中添加Cu2＋的浓度偏高.根据Poitou et al[9]和Hatvani et al[10]的报道 ,低浓度的Cu2＋对菌丝生长起促进作用 ,高浓度的Cu2＋对菌丝的生长则起着抑制作用.在PDA加富培养基中添加Mn2＋,对菌丝生长有明显的促进作用 ,当浓度为100 mgűL－1时 ,促进作用最显著；但向生产培养基中添加Mn2＋对菌丝生长影响不明显.根据Niess et al[11]的报道 ,Mn2＋对糙皮侧耳菌丝的生长有促进作用.但Hatvani et al对香菇的研究[10]表明 ,在培养基中添加3.1 mmolűL－1MnSO4,对香菇菌丝生长有抑制作用 ,使其菌丝生长速度下降了50%.因此 ,Mn2＋对菌株生长速度的影响 ,与菌株的种类和培养菌株的基质都有关系.

图7 不同微量元素对木聚糖酶酶活的影响Fig.7 Effect of different trace elements on the activities of xylanase

本研究结果表明 ,铜能提高漆酶的活性 ,这与刘杰在杏鲍菇中的研究一致[23].在菌丝整个生长阶段 ,添加的100 mgűkg－1MnSO4űH2O对锰过氧化物酶酶活大小的影响不明显 ,这可能是由于生产培养基中所添加的锰的浓度偏高.张连慧等[24]研究结果表明Mn2＋对菌体的生长很有利 ,但对菌体产锰过氧化物酶并无显著影响.在生产培养基中添加MnSO4űH2O ,使得木质素过氧化物酶的酶活有所下降.李华钟等[25]研究表明 ,适量的Mn2＋可提高木质素过氧化物酶的活性 ,当大量的Mn2＋被氧化成Mn3＋时 ,会抑制木质素过氧化物酶的表达 ,本研究中所添加的Mn2＋浓度可能偏高.本研究结果也表明 ,Ca2＋对木聚糖酶有激活作用 ,Fe2＋、Zn2＋对木聚糖酶酶活有抑制作用 ,这与赵玉蓉[26]研究金属离子对木聚糖酶活性影响的结果一致.

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(责任编辑:叶济蓉)

Effects of trace elements on the mycelial growth and enzyme activities of Hypsizygus marmoreus

SUN Shu-jing ,SHAN Shu-kai ,LI Zhao-feng ,GUO Yan-yan ,CHEN Wen-xing ,HU Kai-hui
(College of Life Sciences ,Fujian Agriculture and Forestry University ,Fuzhou ,Fujian 350002 ,China)

Effects of trace elements on the mycelial growth rate and activities of some enzymes related to substrate degradation of Hypsizigus marmoreus were explored under different cultivation conditions by addition of six trace elements in enriched PDA media and production media.The results showed some metal ions(Mn2＋,Ca2＋,Mo6＋and Fe2＋)could significantly accelerate the mycelial growth in enriched PDA media with the concentration of 100 ,60 ,500 and 100 mgűL－1,respectively.Adding Fe2＋and Cu2＋in pro-duction media had remarkable promoting effects on mycelial growth.Zinc ion inhibited the growth of mycelia when it was added to production media.Copper ion supplementation(100 mgűkg－1)in production media was most beneficial to the activities of laccase ,manganese peroxidase and lignin peroxidase(reaching 39.83 ,19.17 and 9.58 UűmL－1,respectively).However ,there were no sig-nificant effects of all trace elements on the activities of cellulase and xylanase.It suggested that different trace elements had different effects on the mycelial growth of H.marmoreus and the activities of its related enzyme in different substrates.

Hypsizygus marmoreus；trace element；mycelial growth rate；enzyme activity

S63

A

1671-5470(2015)06-0639-07

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.06.014

2015－01－09

2015－06－15

福建省发改委农业五新工程项目(闽发改委投资[2012]931号)；福建省自然基金杰出青年项目(2014J06010)；福建农林大学校杰出青年人才项目(xjq201209)；国家自然基金青年项目(31201669)；教育部博士点基金资助项目(20103515120015).

孙淑静(1978－) ,女 ,副教授 ,博士.研究方向:食用菌遗传育种、基因功能及酶学.Email:shjsun2004＠126.com.通讯作者胡开辉(1962－) ,男 ,教授 ,博士生导师.研究方向:微生物生态和食用真菌.Email:hukaihui62＠126.com.