角鲨烯的高效液相色谱检测法

陈伟珠，晋文慧，张怡评，洪专，*（.国家海洋局第三海洋研究所，福建厦门36005；2.厦门大学化学化工学院化学系，化学生物学福建省重点实验室，福建厦门36005）

角鲨烯的高效液相色谱检测法

陈伟珠1，2，晋文慧1，张怡评1，洪专1，*
（1.国家海洋局第三海洋研究所，福建厦门361005；2.厦门大学化学化工学院化学系，化学生物学福建省重点实验室，福建厦门361005）

摘要：建立了一种高效液相色谱法（HPLC）测定角鲨烯含量的检测方法。采用XBridge RP C18色谱柱（250 mm× 4.6 mm，3.5 μm），流动相为甲醇，流速为1.0 mL/min，检测器为光电二极管阵列检测器，检测波长为210 nm。结果表明，在上述色谱条件下，角鲨烯浓度在2.6 μg/mL～260 μg/mL范围内线性关系良好，相关系数r为0.999 9。检出限（S/N=3）为0.33 μg/mL，定量限（S/N=10）为0.99 μg/mL，精密度RSD（n=6）为0.40%；平均加标回收率为100.78%，相对标准偏差为0.75%。方法准确、灵敏、可靠，可用于角鲨烯的定量和定性分析。

关键词：角鲨烯；高效液相色谱；光电二极管阵列法；测定

角鲨烯常温下为无色油状液体，是一种高度不饱和脂肪族烃类化合物。其最初是从鲨鱼的肝油中发现的，1914年被命名为 Squalene，其化学名称为2，6，10，15，19，23—六甲基—2，6，10，14，18，22—二十四碳六烯，属开链三萜，又称鱼肝油萜，也称鲨烯。目前，角鲨烯主要来自于深海鲨鱼肝油，同时也少量存在于油脂不皂化物中，尤其在橄榄油、棕榈油及其脱臭馏出物中含量较多，菜籽油、大豆油、米糠油、棉籽油等植物油也含有一定量角鲨烯。角鲨烯具有提高体内超氧化物歧化酶（SOD）活性、增强机体免疫能力、改善性功能、抗衰老、抗肿瘤等多种生理功能，可广泛地应用于化妆品、医药、食品等多个行业[1]。近些年来，很多国家已将其列入药物行列，如我国药典中就将角鲨烯作为口服营养药，剂量为每天1 g。

虽然角鲨烯对人体健康有诸多益处，但也有证据表明过量的角鲨烯会产生一定副作用。科学家给老鼠注射角鲨烯后，发现老鼠患上了免疫系统疾病。目前，人们更多地关注角鲨烯对人体健康带来的益处，功能性食品市场上此类产品众多，但是至今为止，我国尚未出台关于角鲨烯测定的国家标准或者规范性文件。本课题旨在研究角鲨烯含量测定的快速简便灵敏方法，以对市场日益增多的此类产品提供质量监控手段。目前，关于角鲨烯检测方法有气相色谱法[2-8]、气相色谱-质谱法[9-10]、高效液相色谱法[4，11-14]以及超高效液相色谱法[15]，但分析时间都比较长，一个样品至少要10 min以上，即使荣维广[15]建立的超高效液相色谱法，样品的出峰时间也要9.9 min。本文采用高效液相色谱法对色谱条件进行优化，样品的分析时间比文献报道的HPLC法时间短，也比超高效液相色谱法短，且灵敏度高，准确性好，是一种简便、快速、准确、环保的检测方法。

1　材料与方法

1.1主要仪器和试剂

1.1.1仪器

Waters 2695高效液相色谱仪配光电二极管阵列检测器：美国Waters公司；Milli-Q纯水机：德国Millipole公司。

1.1.2试验试剂

甲醇、乙腈（色谱纯）；角鲨烯（纯度≥99%）：美国sigma公司。

1.2色谱条件

液相色谱柱：XBridge RP C18（250 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流动相：甲醇；检测波长：210 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL。

1.3标准溶液制备

角鲨烯储备液的制备：精密称取角鲨烯16.3 mg，用乙腈溶解，置于10 mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀配成角鲨烯储备液1630 μg/mL。

2　结果与分析

2.1色谱条件的选择

2.1.1色谱柱的选择

角鲨烯，极性很弱，适合用反相色谱柱。所以本试验选用C18的反相柱。Agilent SB-C18（5 μm，250 mm× 4.6 mm），但是即使流速为2 mL/min，样品出峰时间约13 min，出峰时间太长。改用XBridge RP C18（250 mm× 4.6mm，3.5μm），流速为1mL/min，出峰时间为7.044min（图1），比Agilent SB-C18出峰时间短，所以本试验决定采用XBridge RP C18（250 mm×4.6 mm，3.5 μm）作为角鲨烯的分析色谱柱。

图1　100℃高温破坏的角鲨烯的色谱图Fig.1　The chromatography of squalene destroyed by hightemperature

2.1.2流动相的选择

采用乙腈和甲醇作为流动相体系，试验结果表明甲醇和乙腈作为流动相，100℃高温破坏的角鲨烯样品主峰均能与其它杂质峰分开。但是以乙腈作为流动相，样品的保留时间较甲醇长，所以本试验选择甲醇作为流动相体系。为了考察甲醇/水的不同比例对角鲨烯样品的分离效果的影响，本试验在柱温为35℃和流动相流速为1 mL/min的相同条件下，改变甲醇/水的比例。试验结果表明（如图2所示），样品在甲醇和水不同比例的流动相条件下都能与杂质峰分开，但是随着水比例从0%增加到5%，样品的保留时间增加，当水增加到5%时，样品主峰的保留时间为13.6 min。综合考虑样品的保留时间和分离效果，选择纯甲醇作为流动相。

图2　在不同流动相条件下，100℃高温破坏的角鲨烯的色谱图Fig.2　The chromatography of squalene destroyed by hightemperature under the different mobile phase

2.1.3柱温的选择

在甲醇作为流动相和流速为1 mL/min的相同条件下，改变柱温，考察柱温对分离效果的影响。试验结果表明（如图3所示），柱温为30、35、40℃，样品保留时间分为为6.7、7.0、7.3 min，且样品主峰跟其它杂质峰分离良好。综合考虑样品的保留时间和柱子的使用寿命，柱温选择35℃。

图3　在不同柱温条件下，100℃高温破坏的角鲨烯的色谱图Fig.3　The chromatography of squalene destroyed by hightemperature under the different column temperature

2.2检出限与定量下限

将对照品溶液逐级稀释后，以信噪比S/N=3时的质量浓度为检出限，S/N=10时的质量浓度为定量下限。计算得出检出限为0.33 μg/mL，定量限为0.99 μg/mL。

2.3线性关系

取角鲨烯对照品适量，精密称定13.0 mg，用乙腈溶解，置于10 mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀配成角鲨烯储备液1 300 μg/mL。精密量取不同体积的储备液，配制浓度为2.6、6.5、13.0、32.5、130、260 μg/mL的标准工作溶液，精密量取10 μL注入液相色谱仪，以峰面积（Y）对溶液的质量浓度（X）进行线性回归（如表1所示）。

表1　角鲨烯线性关系测定结果Table 1　The result of linear relation between concentrationof squalene and peak area

结果表明，角鲨烯浓度在2.6 μg/mL～260 μg/mL范围内线性关系良好，回归方程为Y=3500 2X+1962 3 （r=0.999 9）。

2.4精密度与重现性

取2.3项配置的浓度为130 μg/mL的溶液连续进样6次，结果如表2所示，峰面积的RSD（n=6）为0.40%，表明仪器精密度良好。

2.5溶液稳定性

按“标准溶液的制备”方法配制角鲨烯溶液浓度为144 μg/mL，于室温（25℃左右）中放置0、2、4、8、12、24 h后分别按优化后的色谱条件进行测定，计算得到RSD（n=6）为0.63%（见表3），表明样品溶液在室温条件下能稳定保存。

表2　精密度结果Table 2　The result of precision

表3　稳定性试验测定结果Table 3　The result of precision

2.6加标回收率

精密称取不同量的角鲨烯，按照“供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液，在相当于供试品溶液80%、100%、120%的浓度下，分别考察加标回收率。每个浓度制备3份，以供试品溶液峰面积平均值和对照品溶液峰面积平均值的比值作为回收率。结果见表4。

表4　加标回收试验Table 4　Result of recovery test

该方法的平均回收率为100.78%，RSD为0.75%，表明方法的回收率良好。

3　结论

本试验建立了角鲨烯的检测方法，使用反相柱对角鲨烯含量进行直接检测，角鲨烯峰与其他杂质峰得到很好分离，且经方法学考察表明，线性关系、精密度、稳定性、重现性、回收率等均符合分析要求，方法准确。

而且该方法的流速不仅比文献[14]报道的方法低，且样品的保留时间缩短，节约溶剂和时间，尤其适合高通量样品的检测。

参考文献：

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.034

收稿日期：2014-07-02

基金项目：福建省科技计划项目（2015N0009）；厦门海洋研究开发院共建项目（2014）；海洋生物技术产业化中试技术研发公共服务平台（12PZP001SF10）；广东海洋经济发展区域示范项目（GD2012-D01-001）

作者简介：陈伟珠（1981—），女（汉），助理研究员，硕士，研究方向：海洋天然产物标准样品研制与分析。

*通信作者

Determination of Squalene by High Performance Liquid Chromatography with Photodiode Array Detector

CHEN Wei-zhu1，2，JIN Wen-hui1，ZHANG Yi-ping1，HONG Zhuan1，*
（1.The Third Instiute of Oceanography，State Oceanic Administration，Xiamen 361005，Fujian，China；2.Department of Chemistry，College of Chemistry and Chemical Engineering，The Key Laboratory for Chemical Biology of Fujian Province，Xiamen University，Xiamen 361005，Fujian，China）

Abstract：A high-performance liquid chromatography method for the determination of squalene was developed.The determination of squalene was performed on a XBridge RP C18column（250 mm×4.6 mm，3.5 μm）.The mobile phase was methanol，and the flow rate was 1.0 mL/min.The detector was photodiode array detector and the variable wavelength detector（VWD）was set at 210 nm.In the above chromatographic conditions，good linear was observed in the linear range of 2.6 μg/mL-260 μg/mL，and the correlation coefficient r was 0.999 9. The limit of detection（LOD）of squalene was 0.33 μg/mL（S/N=3）.The quantitation of detection（QOD）of squalene was 0.99 μg/mL（S/N=10）.The relative standard deviation（RSD）for the accuracy was 0.40%（n=6） and the average recovery was 100.78%with RSD of 0.75%.The method is sensitive，reliable，accurate and could be used for the determination of squalene.

Key words：squalene；high-performance liquid chromatography（HPLC）；photodiode array detector（PAD）；determination