5种精油和多抗霉素对黄瓜枯萎病原菌抑菌活性的研究

潘彦彪　田永强　张阿强等

摘要 [目的]研究百里香等5种精油对黄瓜枯萎病原菌的抑菌效果，以及筛选出的优选精油和多抗霉素的协同抑菌效果。[方法]采用菌丝生长速率法筛选抑菌效果最强的精油，并检测其最小抑菌浓度（MIC）和EC50，同时研究优选精油和多抗霉素的协同抑菌效果。[结果]精油中百里香的抑制效果最强，EC50为0.309 μl/ml，MIC为0.530 μl/ml。百里香精油和多抗霉素的协同抑菌效果明显大于两者的单一抑菌效果。[结论]试验结果为天然药物农药的开发与利用提供了理论依据。

关键词 黄瓜枯萎病；精油；百里香精油；多抗霉素；抑菌活性

中图分类号 S436.421.1+3 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2015）15-117-04

Research on Antifungal Activities of Five Different Kinds of Essential Oil against Fusarium oxysporum.sp.cucumebrium Owen

PAN Yanbiao， TIAN Yongqiang*， ZHANG Aqiang et al

（School of Chemical and Biological Engineering， Lanzhou Jiaotong University， Lanzhou， Gansu 730070）

Abstract [Objective] To study the bacteriostasis effects on Fusarium oxysporum.sp.cucumebrium Owen which the five different kinds of essential oil have， such as thyme oil etc， and the coordination bacteriostasis effects of the selective preference essential oil and the polyoxin. [Method] Screening the essential oil which has the best bacteriostasis effect by growth rate method and check its MIC and EC50. A comparative study on the coordination bacteriostasis effects of essential oil and the polyoxin was conducted. [Result] The bacteriostasis effect of the thyme oil is the best among others. Its EC50 was 0.309 μl/ml and the MIC was 0.530 μl/ml. Obviously， the coordination bacteriostasis effect of the thyme oil and the polyoxin is better than any one of this two alone. [Conclusion] The study can provide theoretical basis for development and utilization of natural medicine pesticide.

Key words Fusarium oxysporum.sp.cucumebrium Owen； Essential oil； Thyme oil； Polyoxin； Antifungal activities

目前化學农药残留已成为危害人类健康的最大杀手之一，长期食用能诱发癌症等多种疾病。天然药物农药被称为绿色农药，其种类的多样性、抑菌的光谱性、对人体的超低危害性决定了其作为新一代农药的优势[1-5]。笔者采用菌丝生长速率法研究了5种精油对黄瓜枯萎病原菌的抑菌活性，测定了优选精油的MIC和EC50，并研究了该优选精油和多抗霉素的协同抑菌效果，旨在为天然药物农药的开发与利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1

试验材料。百里香精油、桉叶精油、连翘精油、艾叶精油、薄荷精油、多抗霉素均购自化工有限公司；黄瓜枯萎病原菌，土豆，葡萄糖，琼脂。

1.1.2 仪器。

LDZX50FA立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）、SWCJ2FD无菌操作台（江苏苏州净化设备有限公司）、MJ250I霉菌培养箱（上海一恒科技有限公司）、YP1002N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 药物的配制。

1.2.1.1 精油使用液的配制。以无水乙醇和吐温80溶解待测精油，无水乙醇用量为1 ml，吐温80用量为10 μl，待测精油用量依据试验情况而定。

1.2.1.2 多抗霉素使用液的配制。用无菌蒸馏水溶解多抗霉素得到浓度为0.1 g/ml的多抗霉素溶液，待测多抗霉素用量依据试验情况而定。

用0.22 μm微孔滤膜对上述混合液抽滤除菌，现用现配。

1.2.2 抑菌率的测定。

1.2.2.1 药物的初筛。使用菌丝生长速率法测定薄荷、连翘、桉叶、艾叶和百里香的抑菌活性。取5种精油使用液且精油用量相同，在无菌条件下加入250 ml已灭菌的三角瓶中，再加入99 ml已灭菌并冷却到50 ℃左右的PDA培养基，充分摇匀后倒入4个培养皿，每个培养皿25 ml。以等量的乙醇-吐温80混合液加入培养基为空白对照。以青枯立克为阳性对照，按照上述方法配制成2.0 μl/ml的含药培养基。用10 mm打孔器在培养7 d的供试菌菌落边缘打取长势相同的菌饼，接入上述各平板中，每板中央各1枚，菌饼周围要光滑，接菌饼时菌饼在培养基上如有滑动则该平板废弃，菌饼有菌丝的一面朝下。放入28 ℃培养箱中培养，分别在 96、120和144 h后用十字交叉法测量菌落直径，计算精油对菌丝的抑制率。首次筛选采用大幅度浓度梯度，再根据试验结果缩小浓度范围，直到待测精油中有1种或2种有明显抑菌效果，而其他精油无明显抑菌效果时的浓度为最终测试浓度[6-8]。

菌丝生长抑制率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-菌饼直径）×100%

1.2.2.2 优选药物不同浓度的抑菌活性测定。

通过“1.2.2.1”選取抑菌活性最强的精油，进行浓度梯度测定。配制精油使用液且精油含量分别为90、80、70、60、50、40、30、20和10 μl的浓度梯度。采用菌丝生长速率法测定，方法同“1.2.2.1”[9]。

1.2.2.3 不同浓度多抗霉素的抑菌活性测定。

配制多抗霉素使用液含量分别为10、20、50、100、200 mg的浓度梯度。采用菌丝生长速率法测定，方法同“1.2.2.1”[9]。

1.2.2.4 优选药物和多抗霉素的协同抑菌效果。将优选精油和多抗霉素进行复配测试，方法同“1.2.2.1”[9]。

2 结果与分析

2.1 药物的初筛 通过药物初筛的浓度梯度测试，最终确定测试浓度为精油在含药培养基中的浓度是1.0 μl/ml。

由表1和图1可知，在1.0 μl/ml浓度下5种精油中连翘精油对黄瓜枯萎病原菌的抑制效果最差，并且表现出轻微的促进效果。桉叶的抑制率在10%左右，抑菌效果可以忽略。艾叶精油的抑制率明显低于薄荷精油和百里香精油。薄荷精油96 h时的抑菌率高达9000%，但是在144 h时却降到81.65%，明显低于百里香精油连续3个检测时间段的100%的抑制率。从整体来看，百里香精油的抑菌效果最好，薄荷精油次之，艾叶精油的抑菌效果不明显，桉叶精油和连翘精油没有抑菌效果。另外，桉叶、艾叶和薄荷精油的抑菌效果随着时间的延长有下降趋势，由于百里香精油在3个检测时间段的抑菌效果都是100%，因此可以判断百里香精油浓度为10 μl/ml时并不一定是对黄瓜枯萎病原菌毒性抑制的MIC，还需对百里香进行进一步的浓度梯度毒力检测[10-11]。

2.2 优选药物不同浓度的抑菌活性

根据表2数据计算出

百里香精油毒力方程为y=2.262 4x-0.199 3，r=0.985 8，百里香精油对黄瓜枯萎病原菌的EC50为0.309 μl/ml，MIC为0.530 μl/ml。由图2可知，百里香精油浓度大于0.3 μl/ml时对黄瓜枯萎病原菌有明显的抑制作用，且抑菌效果随着时间的延长有下降趋势，所测浓度梯度存在显著性差异[12-14]。

2.3 抗生素多抗霉素不同浓度的抑菌活性

根据表3数据计算出多抗霉素毒力方程为y=0.051 9x+0.187 1，r=0.992 9，多抗霉素对黄瓜枯萎病原菌的EC50为6.029 0 mg/ml，MIC为15.662 8 mg/ml。由图3可知，随着时间的延长，抑菌效果有明显的下降趋势，所测浓度梯度的显著性差异不明显。

2.4 百里香和多抗霉素的协同抑菌活性

2.4.1 0.2 μl/ml百里香和不同浓度多抗霉素的协同抑菌活性。由表4和图4可知，随着时间的延长，百里香和多抗霉素的协同抑菌效果有下降趋势。结合表3和图3可知，在无百里香的情况下，多抗霉素各浓度梯度的抑菌效果无显著性差异，而添加0.2 μl/ml百里香精油之后，各浓度梯度的抑菌效果有显著性差异。

2.4.2 0.1 μl/ml百里香和不同浓度多抗霉素的协同抑菌活性。由表5和图5可知，随着时间的延长，百里香和多抗霉素的协同抑菌效果有下降趋势。参照表3和图3可知，在无百里香的情况下，多抗霉素各浓度梯度的抑菌效果无显著性差异，而添加0.1 μl/ml百里香精油之后，各浓度梯度间存在显著性差异。

注：不同大、小写字母分别表示处理间在0.01、0.05水平差异显著。

图2 百里香不同浓度对黄瓜枯萎病原菌菌丝生长的抑制率变化趋势

2.5 百里香同多抗霉素的协同抑菌效果和百里香、多抗霉素单一抑菌效果的对比

2.5.1 百里香同多抗霉素的协同抑菌效果和百里香、多抗霉素单一抑菌效果的对比（百里香浓度为0.2 μl/ml）。由表6和图6可知，百里香同多抗霉素的协同抑菌效果和百里香、多抗霉素的单一抑菌效果相比，抑菌率大幅度增加。以96 h时百里香浓度为0.2 μl/ml、多抗霉素浓度为2.0 mg/ml为例，百里香和多抗霉素的抑菌率分别为35.06%和45.62%，而两者的协同抑菌效果达到96.00%。同单一抑制

增加了15.32%，同样，在添加了百里香的情况下协同效果较多抗霉素单一情况下增加了50.38%，比百里香单一抑菌效果（35.06%）增加了15.32%，充分体现出1+1﹥2的协同抑菌优势。

2.5.2 百里香同多抗霉素的协同抑菌效果和百里香、多抗霉素单一抑菌效果的对比（百里香浓度为0.1 μl/ml）。由表7和图7可知，百里香同多抗霉素的协同抑菌效果和百里香、多抗霉素的单一抑菌效果相比，抑菌率大幅度增加。

3 结论

5种精油对黄瓜枯萎病原菌抑菌效果大小为：百里香>薄荷>艾叶>桉叶>连翘。其中百里香抑菌效果最强，其各浓度间有显著性差异，表明在所设浓度范围内，浓度变化对菌丝生长影响较大。在百里香和多抗霉素的协同抑制中，两者的混合抑制效果明显大于各单一抑制效果，在百里香精油浓度为0.1 μl/ml时，百里香对黄瓜枯萎病原菌的抑制效果小于5%，已经没有明显抑制效果，但是在加入多抗霉素后，却有着较明显的抑制效果，与单一抑制效果相比，抑菌率有

了大幅度增加。

参考文献

[1]

余俐佳.十万大山 25 种植物抑菌除草活性筛选[D].南宁：广西大学，2012.

[2] 胡仁火，任国祥.9种中药植物抑菌作用的研究[J].安徽农业科学，2007，35（27）：8534-8535.

[3] 郭俊华.功能性植物抑菌沐浴液的研制[J].中国洗涤用品工业，2012 （5）：69-71.

[4] 钱昆，周涛.复配植物抑菌物的超临界萃取及其抑菌特性研究[J].食品科学，2007，27（11）：369-372.

[5] 韩建华，祝木金，冯俊涛，等.27 种植物抑菌活性初步筛选[J].西北农林科技大学学报：自然科学版，2002，30（6）：134-137.

[6] 肖莉春.29 种中药营养价值及对耐药大肠杆菌抑菌活性研究[D].南昌：江西农业大学，2013.

[7] 赖毅东.具有抑菌活性成分中草药的筛选及防腐保鲜应用机理研究 [D].广州：华南理工大学，2003.

[8] 李国林，张忠，毕阳，等.八种植物精油体外抑菌效果的比较[J].食品工业科技，2013，34（7）：130-133.

[9] 李孙洋，邱其伟，刘兴元，等.12 种药用植物粗提物对 4 种植物病原真菌抑菌活性研究[J].中国植保导刊，2014，34（1）：5-9.

[10] 黄聪华.芒萁抑菌有效成分的提取及抑菌机理研究[D].广州：广东工业大学，2013.

[11] 殷帅文，王庆先，聂森，等.狗脊蕨等 10 种植物提取物抑菌活性的初步研究[J].江苏农业科学，2008（1）：88-89.

[12] 刘光明，张俊冬，梁瑞，等.检测杜仲，连翘，大蒜和生姜 4 种药用植物的抑菌效果[J].成都医学院学报，2011，6（3）：241-243.

[13] 丁芬，王亚茹.狼爪瓦松粗提物抑菌效果研究[J].黑龙江医药，2013，26（2）：227-228.

[14] 王占斌，彭巍，蔡纪文，等.两种植物抑菌物质的提取及其抑菌效果测定[J].中国农学通报，2008，24（2）：329-331.