禽流感细胞灭活疫苗（H9亚型，F株）安全性研究

杨廷佳 刘金晨 石宝兰 张 伟 王 浩 李婷婷 赵 娟 沈海峰 周 扬

(国药集团扬州威克生物工程有限公司,江苏扬州 225127)

禽流感细胞灭活疫苗（H9亚型，F株）安全性研究

杨廷佳 刘金晨 石宝兰 张 伟 王 浩 李婷婷 赵 娟 沈海峰 周 扬

(国药集团扬州威克生物工程有限公司,江苏扬州 225127)

将实验室试制的禽流感细胞灭活疫苗(H9亚型,F株) (批号:201201、201202)通过颈部皮下注射的方式单剂量、单剂量重复、超剂量接种10日龄SPF鸡进行安全性试验。免疫后连续监测15天,每周称重,用t检验分析对照组和免疫组体重之间的差异显著性。试验结果表明,免疫接种组和空白对照组体重差异不显著,所制备的禽流感细胞灭活疫苗(H9亚型,F株)不影响鸡的生长性能,安全性良好。

禽流感;细胞灭活疫苗;安全性试验

以H9亚型AIV为代表的LPAI所引起的发病症状主要以呼吸系统疾病表现为主，但可能被混合感染和继发感染其他病原或环境条件等因素所恶化，给养禽业造成极大的经济损失[1，2]。针对我国现流行情况，H9禽流感全病毒灭活疫苗被广泛的用于家禽中，但灭活疫苗有容易引起过敏反应、注射部位易引发炎症等诸多缺点[3，4]。因此，安全性是任何一种生物制品在使用前必须具备的前提条件，为确定实验室试制的禽流感细胞灭活疫苗（H9亚型，F株）对鸡的安全性，特开展本试验，现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 SPF鸡 SPF鸡蛋购自北京梅里亚维通生物技术有限公司，自行孵化，在相对隔离的环境中饲养。

1.1.2 试验疫苗 禽流感细胞灭活疫苗（H9亚型，F株），由国药集团扬州威克生物工程有限公司试制，批号：201201、201202。

1.2 方法

1.2.1 物理性状检验

剂型 在玻璃烧杯内盛入2/3自来水或蒸馏水（22～25℃），静止。用1 ml吸管分别吸取疫苗0.4 ml，垂直缓慢滴于液面上，观察疫苗在水中的变化情况。

粘度 在室温条件下（22～25℃），用内径2.7 mm，出口内径1.2 mm的1 ml吸管，分别吸取各批疫苗样品1 ml，吸管垂直，使疫苗自然流出，计算放出0.4 ml疫苗所需的时间。

稳定性 分别取各批疫苗样品约10 ml，以3000 r/min离心15分钟，观察疫苗分层及水相析出情况。

1.2.2 无菌检验 按现行《中国兽药典》附录作无菌检验。

1.2.3 甲醛含量测定 按现行《中国兽药典》附录进行检验，测定甲醛含量。

1.2.4 单剂量一次接种安全性试验

将10日龄的SPF鸡随机分为3组，每组10只，第1、2组以颈部皮下注射的方式接种疫苗0.2 ml，第3组不免疫作为阴性对照，颈部皮下注射生理盐水0.2 ml。疫苗免疫后，每周测定鸡的体重，用统计学方法分析数据，若P＞0.05则说明体重之间没有显著差异，若P≤0.05则说明两组数据之间存在显著差异。若接种疫苗组鸡的体重明显高于或低于对照组鸡，则说明疫苗不安全；若接种疫苗组鸡和对照组鸡的体重差不显著，则说明疫苗安全。连续观察15天，记录疫苗接种部位和全身的临床反应，然后剖杀所有鸡，重点检查注射部位的病变。

1.2.5 单剂量重复接种安全性试验

试验方法同1.2.4，免疫接种2周后，再重复接种一次，每天观察各组鸡是否出现全身症状，同时每周测定鸡的体重。连续观察15天后剖杀所有鸡，重点检查注射部位的组织病变。

1.2.6 超剂量一次接种安全性试验法

试验分组同1.2.4，试验组每只颈部皮下接种疫苗1 ml（5倍单剂量），每天观察各组鸡是否出现全身症状，同时每周测定鸡的体重。连续观察15天后剖杀所有鸡，重点检查注射部位的组织病变。

2 结果与讨论

2.1 物理性状检验 结果见表1。

外观 为乳白色乳剂。

剂型 疫苗滴于冷水中，呈油滴状不扩散，为油包水型（W/O型）。

稳定性 以3000 r/min离心15分钟，疫苗无分层现象，水相析出＜0.5 ml；在37 ℃左右条件下放置21日，未破乳。

粘度 疫苗垂直自然流出0.4 ml所需时间均小于8s钟，符合规定。

2.2 无菌检验

三批疫苗无菌检验均无菌生长，符合规定。

2.3 甲醛含量测定

按现行《中国兽药典》附录进行检验，符合规定。

表1 疫苗成品检验结果

2.4 单剂量一次、单剂量重复接种安全性试验

免疫后实验鸡精神、饮食饮水状况正常，羽毛有光泽，叫声响亮，未发现因注射疫苗后引起的局部及全身不良反应，15天后逐只进行剖检，注射局部组织未见有明显的肉芽肿胀。单剂量重复接种疫苗后，试验鸡均没有任何临床症状和全身不良反应。剖解，仅个别SPF鸡注射部位残存少量疫苗，但并没有对组织造成的明显的损伤。疫苗免疫对试验鸡的体重增长影响试验结果表明（表2），免疫组和对照组的体重基本一致，差异不显著（P＞0.05），因此疫苗的接种并不影响试验鸡的体重增长，安全性良好，证明实验室试制的疫苗是安全的，可用于鸡的免疫。

2.5 超剂量一次接种安全性试验

超剂量一次注射（5倍正常使用剂量）后，初期SPF鸡都表现出轻微的临床症状，与对照鸡相比，饮食量基本正常、精神稍差，喜卧，之后恢复正常，都没有出现死亡，2～3d症状逐渐消失，精神饮食恢复正常。15天后剖杀，在注射部位均残存有一定量的疫苗，并沿颈部皮下有迁移现象，但注射部位没有出现出血和水肿症状。疫苗免疫对鸡的体重增长影响试验结果见表3，免疫组和对照组的体重差异不显著（P＞0.05），疫苗的接种并不影响实验鸡的体重的增长。

表2 单剂量一次、单剂量重复接种SPF鸡平均体重统计

表3 超剂量一次接种SPF鸡平均体重统计

3 结论

本试验在进行安全检验时，分别进行了单剂量、单剂量重复、超剂量接种，免疫后，不管是接种的局部，还是免疫组鸡的全身，均无临床反应。超剂量接种造成试验鸡在注射初期表现出一定的临床症状，其原因可能是由于鸡只过小或注射剂量过大，刺激注射局部肿胀、疼痛，导致精神稍差，并非疫苗毒性所致的全身反应。接种后每周检测试验鸡体重，接种组和对照组的体重均不存在显著差异，试验结果证明实验室试制的禽流感细胞灭活疫苗（H9亚型，F株）是安全的，制苗工艺是合理的。

[1] Kishida N，Sakoda Y Eto M，Sunaga Y，Kida H．Co-infection of Staphylococcus aureus or Haemophilus paragallinarum exacerbates H9N2 influenza A virus infection in chickens[J]．Arch Virol，2004，149（11）：2095-2104．

[2] 万晓朋，曾显营，田国彬.H9N2亚型禽流感流行株灭活疫苗种毒的筛选[J].中国预防兽医学报，2010，32（4）：276-280.

[3] 李新生，陈红英，黄宗梅，等.鸡新城疫-传染性支气管炎-禽流感（H9N2）三联灭活疫苗的安全性研究[J].中国畜牧兽医，2010，（7）：1671-7236.

[4] 刘淑红，焦铁军，李河林，等.鸡新城疫、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗的安全性和免疫效力试验[J].中国兽药杂志，2013，47（2）：14-17.