HPLC-ELSD法测定不同海拔高度桔梗皂苷的含量

陈良胜 方应权

HPLC-ELSD法测定不同海拔高度桔梗皂苷的含量

陈良胜 方应权

目的测定大别山不同海拔高度桔梗药材的桔梗皂苷的含量, 为评价其质量品质提供理论依据。方法采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)法, KinetexC18色谱柱(4.6 mm×100 mm, 5 μm)；流动相乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B), 梯度洗脱；流速0.4 ml/min。结果1000 m海拔高度以上地区桔梗药材的皂苷含量差异性显著, 700 m高度以下地区桔梗皂苷含量无显著差异。结论桔梗皂苷的含量可能受阳光、气温等外在因子影响而发生变化, 为有效控制桔梗药材的质量提供依据。

桔梗；海拔高度；高效液相色谱-蒸发光散射检测器； 含量测定

桔梗(Radix Platycodi)为桔梗科植物桔梗Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC.的干燥根, 在我国药用历史悠久, 具有宣肺、利咽、祛痰和排脓之效［1-3］。桔梗中主要成分是桔梗皂苷,现代药理研究试验表明：桔梗中的主要活性物质桔梗总皂苷具有广泛的生物活性, 在免疫调节、抗炎、镇痛、解热、祛痰、保肝、降胆固醇、降血脂等方面的药理活性引起了国内外的广泛关注。桔梗在大别山均有种植, 气候适宜, 病虫害较少, 栽培技术成熟, 地形复杂且变化多样, 各个海拔高度都有, 从丘陵到高山, 海拔高差大, 立体气候明显。本实验采用HPLC-ELSD法, 桔梗对照品桔梗皂苷D, 测定不同海拔高度的桔梗皂苷含量, 探索海拔高度对桔梗药材的质量的影响, 以期为桔梗药材的质量评价提供可靠的科学依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

1.1.1 仪器 AGILENT 1100 LC 高效液相色谱仪(美国)；AGILENT CHEMSTAT ION 工作站(美国安捷伦科技公司)；检测器：AGILENT DAD；色谱柱：Phenomenex-C18柱(250 mm×4.6 mm, 粒度5 μm；迪马公司)；KQ-250B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；梅特勒ME215S十万分之一电子天平; 梅特勒CP224S万分之一电子天平；超声波清洗仪SD3200 (昆山市超声仪器有限公司)；LK-COOA摇摆式高速中药粉碎机。

1.1.2 试药 桔梗皂苷D对照品(中国药品生物制品检定所, 批号为：111851-201204, 含量94.9%)；乙腈：色谱纯；甲醇,甲酸∶分析纯(川东化工集团有限公司化学试剂厂)；超纯水 (自制)。桔梗药材样品采自大别山区鸡公山不同海拔高度,见表1。共12批, 同一海拔地区横向间隔100～150 m采一次样, 将12批样混合均匀, 粉粹干燥至恒重备用。并经重庆万州食品药品检验所方应权教授鉴定为桔梗科桔梗属植物桔梗Platycodon grandiflorμm(Jacq.)A.DC.的根。

1.2 方法［4-6］

1.2.1 色谱条件 色谱柱：KinetexC18色谱柱(4.6 mm×100 mm, 5 μm)；流动相：流动相乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B), 梯度洗脱。见表1。流速：0.4 ml/min；进样量：20 μl。

1.2.2 溶液的制备

1.2.2.1 对照品溶液的制备 精密称定桔梗皂苷D对照品5.65 mg, 置于10 ml量瓶中, 加50%甲醇稀释至刻度, 过0.45 μm微孔滤膜滤过即得, 进样20 μl。见图1。

图1 桔梗皂苷D对照品色谱图

1.2.2.2 供试品溶液的制备 取桔梗药材粉末(过二号筛)精密称定2 g, 置锥形瓶中, 精密加入50 %甲醇25 ml, 超声提取30 min, 放冷, 再称定重量, 用50 %甲醇补足重量, 滤过,取续滤液, 过0.45 μm微孔滤膜滤过即得, 进样20 μl。见图2。

图2 桔梗药材样品色谱图

1.2.3 方法学考察

1.2.3.1 标准曲线的绘制 精密吸取桔梗皂苷D标准品溶液 40、80、160、200、2400 μl, 置 10 ml 具塞磨口试管中,于水浴蒸发至干, 精密加10%香草醛试液 0.5 ml, 60% 硫酸 5 ml 摇匀, 于水浴加热 15 min, 冰水浴中冷却 3 min, 以同法平行处理的空白溶剂为空白, 在472 nm处测定吸光度。以标准品浓度C (μl/ml) 为横坐标, 吸光度A为纵坐标绘制标准曲线, 得到回归方程为: A=0.0034 C+0.0064, r=0.9997, 结果看出C在此浓度系列范围内与A呈现良好的线性关系。

1.2.3.2 精密度试验 取同一批次桔梗样品溶液, 按“2.1”项下条件连续进样6次, 记录指纹图谱。计算各共有峰相对峰面积和相对保留时间的相对标准偏差(RSD)值, 结果显示, RSD均<3%, 表明精密度良好。

1.2.3.3 重复性试验 取同一批次桔梗样品溶液共6份,按“2.1” 项下条件分别进样20 μl, 记录指纹图谱。计算各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD值, 结果显示, RSD均<3%, 表明重复性良好。

1.2.3.4 稳定性试验 取同一批次桔梗样品溶液, 分别在0、2、4、6、8、12、24 h检测, 记录指纹图谱。计算各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD值, 结果显示, RSD均<3%, 表明供试品溶液在室温下24 h内稳定性良好。

1.2.3.5 加样回收率实验 准确称取已知含量的桔梗药材已干燥粉末6份, 每份0.05 g, 加入桔梗皂苷 D 适量, 按照上述方法制备样品溶液, 各取20 μl样品液, 测定吸光度, 计算回收率。平均加样回收率为96.97%, RSD为1.51%。

1.3 统计学方法 采用DAS2.0药物代谢动力学软件对数据进行回归分析。

2 结果

依据方法“1.2”对不同海拔高度的12批次的桔梗皂苷含量测定。结果见表1。

表1 桔梗药材药品来源

3 小结

海拔高度对桔梗药材成分影响较显著, 700 m以下地区桔梗皂苷的含量无明显差异, 较为接近, 700 m以上地区桔梗皂苷的含量出现明显变化, 说明高海拔地区种植条件、产地对桔梗药材产生影响。800 m以上地区阳光、气温等环境因素与低海拔丘陵山地地区出现较为大的变化。受到其他因素影响(气候、土壤环境、采收时间等), 为保证桔梗药材质量的稳定、可靠, 建议适宜的区域化种植。而桔梗皂苷含量与外在因子的相关性研究尚需进一步研究。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京: 中国医药科技出版社, 2010: 259-260.

［2］李文庭, 祝明, 马临科, 等.桔梗的HPLC-ELSD指纹图谱研究.中国实验方剂学杂志, 2011, 17(22): 50-53.

［3］李喜凤, 杜云锋, 谢新年, 等.不同采收期桔梗 HPLC指纹图谱比较研究. 中成药, 2010, 32(3) : 353.

［4］杨海玲, 张振凌, 李俊雅, 等.河南省不同产区桔梗饮片 HPLC指纹图谱研究. 河南科技, 2010(5): 66.

［5］李喜凤, 杜云锋, 谢新年, 等.不同产地桔梗药材HPLC 指纹图谱及桔梗皂苷D含量测定研究. 中成药, 2010, 32(4) : 529.

［6］宋健, 王颖, 石俊英.山东地产药材桔梗的HPLC指纹图谱研究.中国现代中药, 2011, 13(9): 21-23.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.04.183

2014-10-21］

465550 河南省新县人民医院(陈良胜)；重庆三峡医药高等专科学校(方应权)

陈良胜