临产前后绒毛膜中激活的NF-κB与PGF合成调节酶的相关性

丁晓颖，黄 鹰，王晓波，高青云，储莉鸣

(上海市浦东新区妇幼保健院妇产科，上海201206)

临产前后绒毛膜中激活的NF-κB与PGF合成调节酶的相关性

丁晓颖，黄 鹰，王晓波，高青云，储莉鸣

(上海市浦东新区妇幼保健院妇产科，上海201206)

目的 分析足月妊娠妇女临产前后绒毛膜中核因子-κB(NF-κB)的激活与前列腺素F(PGF)合成调节酶的蛋白表达变化及其相关性。方法 收集足月妊娠临产及未临产妇女各15例的绒毛膜组织，采用Western Blot方法检测其中NF-κB的激活水平以及环氧合酶(COX)-2、醛糖还原酶(AKR1B)1的蛋白水平，并分析NF-κB的激活水平与COX-2、AKR1B1表达的相关性。结果 ①临产组绒毛膜中COX-2、AKR1B1的蛋白水平均高于未临产组，差异均有极显著性(F值分别为7.737和8.772，均P<0.01)；NF-κB的激活水平也高于未临产组，差异有显著性(F=38.563，P<0.05)；②临产前后绒毛膜中NF-κB的激活水平与COX-2、AKR1B1的表达水平均呈显著正相关(r值分别为0.243和0.168，均P<0.05)。结论 临产后绒毛膜中激活的NF-κB和PGF合成调节酶的表达水平增高，且NF-κB的激活可以上调PGF合成调节酶表达的过程，导致PGF合成增加，这可能是NF-κB参与足月妊娠分娩启动的机制之一。

核因子-κB；环氧合酶-2；醛糖还原酶1；临产；绒毛膜

早产的全球发病率为9.6%，每年有超过100万的新生儿死于早产[1]，给社会和家庭带来了极大的负担。早产问题至今悬而未决，其关键是因为分娩启动的具体机制尚未阐明。前列腺素F(prostaglandin F，PGF)一直被认为是诱发子宫收缩的主要内源性因子，羊膜和绒毛膜是其生成的主要场所。膜磷脂在一系列酶的催化下生成PGF，其中环氧合酶(cyclooxygenase，COX)-2是PGF合成过程中的限速酶，以往对PGF合成酶的研究也多集中在COX-2上[2]。前列腺素F合成酶(prostaglandin F synthase，PGFS)是PGF2α合成过程中的末端限速酶，目前已发现有3个亚型：醛糖还原酶-1(aldo-ketoreductase B-1，AKR1B1)、二氢二醇去氢酶3和羰基还原酶1，其中AKR1B1高表达于绒毛膜组织，但目前国内尚无临产前后绒毛膜中AKR1B1是否具有差异表达的研究报道。

近年来研究发现，核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)的激活与人类分娩启动密切相关[3]。对NF-κB的激活水平的研究主要集中在磷酸化p65亚基(pp65)[4]上；但是，在绒毛膜中临产前后NF-κB是否被激活，NF-kB的激活是否与PGF合成调节酶COX-2和AKR1B1的表达有关？目前鲜有文献报道。本研究采用Western Blot方法检测临产前后绒毛膜中COX-2、AKR1B1和NF-κB激活蛋白的变化并分析COX-2、AKR1B1水平与NF-κB激活的相关性，从而明确NF-κB激活是否与临产前后绒毛膜PGF生产量的变化有关，为明确人类分娩启动机制以及早产的预防提供新的理论依据。

1 资料与方法

1.1 资料

随机选取2012年12月至2013年12月期间单胎、妊娠37～42周，于上海市浦东新区妇幼保健院行子宫下段剖宫产术的产妇30例，其中未临产和临产者各15例，剔除妊娠期糖尿病、子痫前期等妊娠合并症及并发症者。本次实验共分两组：研究组为足月妊娠临产(term labor，TL)组，TL的纳入标准[5]是在无催产素或前列腺素干预的前提下，出现规律且逐渐增强的宫缩，同时伴有宫颈管消失、宫口扩张和胎先露下降，因活跃期停滞、胎儿宫内窘迫等因素行子宫下段剖宫产术的患者；对照组为足月妊娠未临产(term non-labor，TNL)组，TNL的纳入标准是在无宫缩、见红及胎膜早破的前提下，因臀位、社会因素行子宫下段剖宫产术的患者。

1.2 试验方法

1.2.1 标本采集及处理

在患者知情同意的前提下，当剖宫产术中胎儿胎盘娩出后，将绒毛膜组织放入预冷的生理盐水中漂洗后，取100mg绒毛膜组织剪碎置于含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液中进行组织匀浆。12 000rpm，4℃离心20分钟，取上清液，BCA检测试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)测定蛋白含量。

1.2.2 Western印迹检测环氧合酶-2、醛糖还原酶1和pp-65蛋白水平

取上述抽提的绒毛膜组织总蛋白100μg，10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，目的蛋白转移至硝酸纤维素膜上。然后用含5%脱脂牛奶的Tris-盐酸缓冲盐溶液封闭2小时，COX-2、AKR1B1和pp-65等蛋白一抗分别4℃孵育过夜。第2天用1:1 000辣根过氧化物酶结合的二抗(santa Cruz)室温孵育1.5小时，用增强型化学发光试剂盒(美国Millipore公司)进行显色。结果应用美国ImagerJ图像软件系统进行定量分析，用COX-2、AKR1B1蛋白条带的灰度值与b-actin蛋白条带的灰度值的比值代表COX-2、AKR1B1的相对表达含量，用pp65蛋白条带的灰度值与p65蛋白条带的灰度值的比值来代表NF-kB的激活程度。

1.3 统计学方法

应用SPSS 11.0统计软件，对各组数据进行统计分析。实验结果采用均数±标准差表示，组间差别采用LSD-t检验后再以单因素方差分析(ANOVA)进行统计，相关性分析采用线性相关系数r来表示，以P<0.05为差异有显著性，P<0.01为差异有极显著性。

2 结果

2.1 一般情况比较

两组研究对象在年龄、孕周、孕妇体质指数(BMI)、产前胎儿脐血流指数(S/D值)、新生儿体重等因素进行比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表1。

表1 两组孕产妇一般情况比较

2.2 环氧合酶-2、醛糖还原酶1和pp-65在临产前后绒毛膜中的表达情况

COX-2、AKR1B1和pp-65蛋白在临产组与未临产组的绒毛膜中均有表达，见图1；与未临产组相比，临产组绒毛膜中COX-2和AKR1B1的表达水平明显高于未临产组，差异均有极显著性(均P<0.01)；临产组绒毛膜中激活的NF-κB(pp-65)的表达水平也高于未临产组，差异有显著性(P<0.05)，见表2。

A

B

图1 临产前后绒毛膜中COX-2、AKR1B1(A)及pp65(B)的蛋白Western印迹图

Fig.1 Western expression of COX-2, AKR1B1(A) and pp65(B) in chorion before and after labor

Table 2 Comparison of COX-2,AKR1B1 and pp65 in chorion between two groups

注：表头中斜杠后的是校验蛋白，结果采用二者之比可大大减少误差。

2.3 临产前后环氧合酶-2、醛糖还原酶1的表达与pp65的相关性

为了解PGF合成相关酶的表达与NF-κB激活的关系，对临产前后COX-2和AKR1B1的蛋白水平与pp65的表达水平进行了相关性分析，结果发现临产前后绒毛膜中pp65的水平与COX-2的表达有显著相关性(r=0.243，P<0.05)，见图2；pp65的水平与AKR1B1的表达也有显著相关性(r=0.168，P<0.05)，见图3。

图2 足月妊娠绒毛膜中pp65对COX-2表达的影响(n=15，P=0.006 vs TNL)

Fig.2 Influence of pp65 on the expression of COX-2 in chorion of term pregnancy (n=15,P=0.006 vs TNL)

图3 足月妊娠绒毛膜中pp65对AKR1B1表达的影响(n=15，P=0.024 vs TNL)

Fig.3 Influence of pp65 on the expression of AKR1B1 in chorion of term pregnancy (n=15,P=0.024 vs TNL)

3 讨论

3.1 前列腺素F合成调节酶与分娩启动的关系

在正常足月妊娠过程中，子宫肌层处于一种相对静止状态，至妊娠末期，它会进入前宫缩状态，导致肌细胞对各种激素信号和压力改变做出反应，从而引起子宫平滑肌的收缩。目前认为这种转变与临产前后一系列子宫激活蛋白的表达改变有关。子宫激活蛋白包括以下4种类型：①子宫收缩因子合成酶或代谢酶；②子宫收缩/舒张激动剂受体；③离子通道蛋白；④缝隙连接蛋白。COX-2和AKR1B1即属于子宫收缩因子(PGF)合成酶类蛋白。COX-2将花生四烯酸转化成不稳定的前列腺素H2(prostaglandin H2，PGH2)，然后，PGFS催化COX产物PGH2转化成PGF2α。由此可见，COX-2是PGF合成过程中的关键限速酶，而且由于COX-2的可诱导性表达，其在妊娠分娩过程中的作用一直受到国内外学者的广泛关注。以往对COX-2的研究多集中在羊膜，近来Mitchell等[6]研究发现绒毛膜组织中不仅有COX-2的表达，而且COX-2 mRNA水平随着孕周的增加而增加，至分娩前最为显著。胡艳等[7]采用免疫组化法观察COX-2在早产、足月临产、足月未临产者绒毛膜中的表达情况，结果发现早产组绒毛膜组织中COX-2的表达高于足月临产和未临产组，足月临产组绒毛膜中COX-2的表达又高于未临产组。这提示位于羊膜与子宫肌层间的绒毛膜，其中COX-2的表达与分娩的启动密切相关。本实验结果显示，COX-2在足月妊娠临产前后的绒毛膜中均有表达，但在临产以后的绒毛膜中呈增强表达趋势，与胡艳等的结果一致，进一步证实了绒毛膜中COX-2表达的增强与足月妊娠分娩启动的相关性。

AKR1B1属于醛糖还原酶超家族，起初在研究人体血糖高浓度时发现AKR1B1可以使血葡萄糖转化为山梨糖醇。Kabututu等[8]报道AKR1B1还可以将PGH2转化为PGF，从而在PGF合成过程中发挥着重要的作用。值得注意的是，AKR1B1在羊膜中微弱表达，却高表达于绒毛膜组织，脂多糖可以诱导其表达增加[9]，不仅如此，绒毛膜中AKR1B1转化PGH2至PGF2α的作用也强于AKR1C3[8]。于是设想，能否从可诱导性表达的AKR1B1入手，来探索分娩启动的确切机制，但国内尚无临产前后绒毛膜中AKR1B1变化情况的报道。本研究结果显示，临产组人绒毛膜组织中AKR1B1的蛋白水平较未临产组显著升高。这一发现提示，作为PGF合成过程中的关键限速酶和末端限速酶，临产后COX-2和AKR1B1的这种表达变化可以使得PGF合成增加，推动子宫平滑肌由静息态转为收缩态，进而参与分娩的启动，而如何通过抑制COX-2和AKR1B1的表达来防治早产的发生，尚需进一步深入的研究。

3.2 核因子-κB的激活与分娩启动的关系

NF-κB是由两种Rel家族蛋白质构成的二聚体蛋白质，表达于人体绝大多数细胞中，激活的NF-κB通过调节细胞因子、趋化因子、粘附分子、转录因子等一系列特异基因的表达而参与多种生理、病理过程的调节。通常所说激活的NF-κB是指p65和p50组成的异源二聚体，而目前对NF-κB转录活性的研究主要集中在p65分子上，一般认为p65分子中多个位点的磷酸化状态与其转录活性有关。随着分娩动因研究的不断进展，近年来发现NF-κB与妊娠关系密切。国外研究报道NF-κB蛋白在胎盘[10]、胎膜和蜕膜[11]组织都有表达，但国内相关报道甚少，尤其是对绒毛膜中NF-κB表达情况的研究极少。Yan等[12]曾报道NF-κB p65在羊膜、绒毛膜中都有表达，但羊膜和绒毛膜中p65的水平不随孕周的增加和临产的发动而改变。赵文举等[13]在研究后提出了不同的观点，其发现p65在未临产组及临产组的平滑绒毛膜组织均有表达，并且在临产组表达增加。本实验结果显示，pp65在足月妊娠临产与未临产组都有表达，但在临产组中的表达水平显著高于未临产组，差异有显著性，进而认为NF-κB的激活可能在足月妊娠的分娩启动中发挥着重要的作用。

3.3 核因子-κB的激活与前列腺素F合成调节酶的相关性

NF-κB是怎样参与分娩启动的呢？随着对妊娠过程NF-κB作用的研究愈加深入，有研究发现NF-κB的DNA结合位点基序为5’-GGGNRYYY CC-3’，可以与多种基因启动子部位的κB序列特异结合而促进其转录表达。在COX-2基因启动子中包含2个NF-κB位点，这2个位点中1个或2个突变都会显著降低COX-2的基因转录。体外试验已经证实IL-1β和TNF-α均可以刺激上调绒毛膜滋养层细胞中COX-2的表达，进而促进前列腺素合成增多[14]。本研究结果显示，绒毛膜中pp65与COX-2、AKR1B1的表达均呈正相关，故认为绒毛膜中激活的NF-κB可以上调COX-2与AKR1B1的表达，NF-κB通过与这些靶基因上κB结合位点的特异性结合，从而在转录水平调节其表达。这种调控的结果进一步引起前列腺素PGF合成增多，促进宫颈成熟，胎膜破裂，子宫收缩，在分娩的启动和维持中发挥着重要的作用。

综上所述，本研究初步发现足月妊娠临产前后激活的NF-κB与绒毛膜中PGF2α的合成明显相关，那么能否通过调控NF-κB的激活来控制PG的生成以调节分娩，或是通过对可诱导型PG合成酶的干预来调节PG的合成，进而应用于临床早产的防治，今后有望从这一方面进一步扩大样本量后继续研究。

[1]Chandiramani M, Seed P T,Orsi N M,etal.Limited relationship between cervico vaginal fluid cytokine profiles and cervical shortening in women at high of spontaneous preterm Birth[J].PloS One,2012,7(12):e52412.

[2]Thiex N W,Chames M C,Loch-Caruso R K.Tissue-specific induction of COX-2 and prostaglandins in lipopolysaccharide-stimulated extraplacental human gestational membranes in a 2-chamber transwell culture system[J].Reprod Sci,2010,17(12):1120-1129.

[3]Khanjani S, Kandola M K, Lindstrom T M,etal.NF-kappaB regulates a cassette of immune /inflammatory genes in human pregnant myometrium at term[J].J Cell Mol Med,2011,15(4):809-824.

[4]Lorenzi S, Forloni M, Cifaldi L,etal.IRF1 and NF-kB restore MHC class I-restricted tumor antigen processing and presentation to cytotoxic T cells in aggressive neuroblastoma[J].PloS One,2012,7(10):e46928.

[5]谢幸,苟文丽.妇产科学[M].8版.北京:人民卫生出版社,2013,3:117.

[6]Mitchell M D, SatoTawang A, Keelan J A,etal.Cannabinoids stimulate prostaglandin production by human gestational tissues through a tissue and CBl-receptor-specificmechanism[J].Am J Physiology,2008,294(2p1):E352-E356.

[7]胡艳,丁依玲．环氧合酶-2在早产产妇胎膜组织中的表达及意义[J].中南大学学报(医学版),2005,30(2):190-192.

[8]Kabututu Z, Manin M, Pointud J C,etal.Prostaglandin F2αSynthase Activities of Aldo-Keto Reductase 1B1, 1B3 and 1B7[J].J Bio chem,2009,145(2):161-168.

[9]Breuiller Fouche M, Leroy M J, Dubois O,etal.Differential expression of the enzymatic system controlling synthesis, metabolism, and transport of PGF2alpha in human fetal membranes[J].Bio Reprod,2010,83(1):155-162.

[10]Mendieta H, Parada Z A, Amaya F A,etal.Pregnancy Weight Gain Limitation by a Supervised Nutritional Program Influences Placental NF-κB/IKK Complex Expression and Oxidative Stress[J].J Oman Med,2013(3):167-172.

[11]Vora S,Abbas A,Kim C J,etal.Nuclear factor-kappa B localization and function within intrauterine tissues from term and preterm labor and cultured fetal membranes[J].Reprod Biol Endocrin,2010(8):8.

[12]Yan X，Sun M，Gibb W.Localization of Nuclear Factor-kB(NFkB) and In- Hibitory Factor-kB(IkB) in human fetal membranes and decidua at termand preterm delivery[J].Placenta,2002,23(4)：288-293.

[13]赵文举,张丹妮,李海梅.孕足月产程发动前后NF-kB蛋白在平滑绒毛膜的表达及其意义[J].中国实验诊断学,2010,7(14):1133-1134.

[14]Premyslova M, Li W, Alfaidy N,etal.Differential expression and regulation of microsomal prostaglandin E(2) synthase in human fetal membranes and placenta with infection and in cultured trophoblast cells[J].J Clin Endocrinol & Metab,2003,88(12):6040-6047.

[专业责任编辑：杨文方]

Correlation between activated NF-κB and synthetase regulating PGF in chorion before and after labor

DING Xiao-ying, HUANG Ying, WANG Xiao-bo, GAO Qing-yun, CHU Li-ming

(DepartmentofGynecologyandObstetrics,PudongDistrictHealthcareHospitalforWomenandChildren,Shanghai201206,China)

Objective To study the changes and relationship between activation of NF-κB and the expression of PGF synthetase in chorion before and after labor in term pregnancy. Methods Fifteen cases of term labor (TL) and 15 cases of term non-labor (TNL) were selected as the objects of study. Western Blot test was used to observe the expression of activated NF-κB, COX-2 and AKR1B1 in their chorion, and the correlation between them was analyzed. Results Compared with the TNL group, the levels of COX-2 and AKR1B1 increased in TL group, there were significant differences between two groups (Fvalue was 7.737 and 8.772, respectively, bothP<0.01), and the level of activated NF-κB was also higher in TL group (F=38.563,P<0.05). Both the expressions of COX-2 and AKR1B1 were positively correlated with the activated NF-κB in chorion before and after labor (rvalue was 0.243 and 0.168, respectively, bothP<0.05). Conclusion The levels of NF-κB, COX-2 and AKR1B1 protein increase in human chorion after labor, and the activated NF-κB can up-regulate the expression of PGF synthetase and lead to increased synthesis of PGF. It may be the mechanism of NF-κB participating in initiation of labor.

nuclear factor kappa B(NF-κB)；cyclooxygenase-2(COX-2)；aldo-ketoreductase B-1(AKR1B1)；labor；chorion

2014-12-14

上海市卫计委课题基金资助项目(课题编号：201440003)

丁晓颖(1973-)，女，主治医师，硕士，主要从事围产医学的研究。

储莉鸣，副主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.02.027

R714.7

A

1673-5293(2015)02-0248-03