SDF-1α通过p38MAPK-HIF-1α通路加强卵巢癌细胞转移的机制探讨

薛宝瑶，赵 静，张西愿，姜 霞，周 卓，于月成

(第四军医大学西京医院妇产科，陕西 西安710032)

SDF-1α通过p38MAPK-HIF-1α通路加强卵巢癌细胞转移的机制探讨

薛宝瑶，赵 静，张西愿，姜 霞，周 卓，于月成

(第四军医大学西京医院妇产科，陕西 西安710032)

目的 明确缺氧诱导因子-lα(HIF-1α)在基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)调控的卵巢癌细胞迁移中的作用及其机制。方法 采用免疫组化分析HIF-1α在卵巢癌组织中的表达水平；将HIF-1α siRNA转染SKOV3卵巢癌细胞，分别用SDF-1α和SDF-1α+SB203580处理，用RT-PCR及western blotting分析HIF-1α、p38MAPK的表达水平。结果 免疫组化分析表明，HIF-1α在卵巢癌组织中高表达，同时SDF-1α可明显诱导HIF-1α的mRNA及蛋白水平的表达；当用HIF-1α siRNA转染后，细胞中HIF-1α的表达水平明显下降。当用通路抑制剂SB203580处理后，SDF-1α诱导的HIF-1α水平明显降低。结论 SDF-1α可通过p38MAPK-HIF-1α通路来调控卵巢癌细胞的迁移。因此，该研究将为卵巢癌的防治提供新的研究方向。

基质细胞衍生因子-1α；丝裂原活化蛋白激酶通路；缺氧诱导因子-lα；卵巢癌；细胞迁移

基质细胞衍生因子(stromal cell-derived factor-1 alpha，SDF-1α)(趋化因子CXCL12)在肿瘤的发病机制中起着重要的作用，然而其具体的机制仍然不明。缺氧诱导因子-lα(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)被认为在参与肿瘤发生、发展等生物学方面起到重要作用，其源于HIF-1α上调了SDF-1α表达促进了干细胞黏附、迁移[1]。本研究主要观察和分析SDF-1α激活PI3K/AKT和MAPK通路促进HIF-1α的表达，从而促进卵巢癌细胞的转移，明确卵巢癌转移机制，有望为卵巢癌的靶向治疗提供新思路及临床指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料

人卵巢癌细胞SKOV3由第四军医大学细胞工程中心提供，McCoy’5A培养基购自Gibic；兔抗人HIF-lα多克降抗体、兔抗人p38、pp38多克隆抗体、SB203580购自美国Santa cruz公司，兔抗人β-actin抗体购自上海生工生物工程有限公司，DAB显色剂(棕色)购自福州迈新生物技术开发有限公司；脂质体LipofeetamineTM 2000购自Invitroge，HIF-1α基因干扰片段由大连宝生物工程有限公司设计合成；TRIzol试剂、real-time RT-PCR试剂盒购自TaKaRa，HIF-1α mRNA引物由Takara公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及处理

将人卵巢癌细胞SKOV3置于含10%胎牛血清McCoy’5A培养基，37℃以及含有5%CO2的环境中培养，分为3组：A组卵巢癌细胞control，B组卵巢癌细胞加入外源SDF-1α，C组细胞转染HIF-1α siRNA或细胞培养基中加入SB203580。

1.2.2 免疫组化染色

收集第四军医大学西京医院病理科卵巢癌患者石蜡组织块，制备切片，将石蜡切片常规脱蜡水化，3%过氧化氢灭活内源性过氧化酶20min，枸橼酸钠煮沸修复抗原20min，加入兔抗人SDF-1α单克隆抗体、兔抗人HIF-1α单克隆抗体(1:200、4℃、过夜)，PBS洗片后二抗封闭40min，链霉亲和素-过氧化物酶封闭40min，DAB显色，苏木素衬染、脱水、透明、封片。PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.3 缺氧诱导因子-1α沉默RNA转染

调整浓度SKOV3细胞(8～10)×104/L接种至6孔板，在含10%胎牛血清的McCoy’5A培养基中培养24h，细胞汇合度达到90%～95%。将稀释好的HIF-1α siRNA和Lipofeetamine 2000试剂混合，形成HIF-1α siRNA/Lipofectamine 2000复合物。将HIF-1αsiRNA转染载体加到含有细胞和培养基的培养板孔中融合，然后放入37℃、5%CO2培养箱培养。6h后换含10%胎牛血清的McCoy’5A培养基，20h恢复生长后，转染空白质粒Lipofeetamine 2000组作为对照，利用Western Blot检测转染效率。

1.2.4 实时荧光定量逆转录多聚酶链反应检测

TRIzol法提取6孔板内各组细胞的总RNA并定量；各样本取3ng～3g总RNA，按TaKaRa公司试剂盒说明进行逆转录合成eDNA。应用实时荧光定量RT-PCR检测，β-actin作为内参照。PCR引物：HIF-1α正义链5-TTGCTCAT￣CAGTT￣GCCACTTCC-3，反义链5-AGCAATTCATCTGT￣GCTTTCATGTC-3。具体实验过程参考TaKaRa公司的real-time RT-PCR试剂盒进行。

1.2.5 蛋白印迹法检测

将细胞悬液经离心、纯化，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳，匀浆中的各种成分会在凝胶中分开。之后，将凝胶中的蛋白质转移到PVDF (polyvinylidene difluoride)膜上，加入第一抗体，孵育24h后，再加入第二抗体，后加入ECL (enhancer chemiluminescence)加强发光反应。最后，将“膜”与X线片相重叠，反应发出的光就会使X线片曝光，冲洗后可见所选择蛋白所在的位置。通过蛋白印迹法检测细胞中p38/pp38以及HIF-1α的表达水平。

2 结果

2.1 缺氧诱导因子-1α在上皮性卵巢癌组织中的表达水平

免疫组化分析表明，HIF-1α在9例正常卵巢中无阳性表达，阳性表达率为0；HIF-1α在97例卵巢癌患者组织中65例呈阳性表达，阳性表达率为67.0%,HIF-1α在上皮性卵巢癌中的表达见图1A、图1B。

2.2 基质细胞衍生因子-1α诱导缺氧诱导因子-1α的表达

RT-PCR分析表明，SDF-1α刺激后可明显诱导人卵巢癌细胞SKOV3中HIF-1α的mRNA水平，见图2，表明SDF-1α能够促使卵巢癌细胞表达HIF-1α。

2.3 缺氧诱导因子-1α沉默RNA转染对细胞中缺氧诱导因子-1α表达水平的影响

Western blotting分析表明，HIF-1α siRNA转染后细胞中HIF-1α的蛋白水平明显下降，见图3，提示成功构建HIF-1α沉默的细胞模型。

图1A 图1B

注：图1A为阴性对照(SP×400)；图1B为HIF-1α在卵巢癌患者组织中的阳性表达(SP×400)。

图1 缺氧诱导因子-1α在上皮性卵巢癌中的表达

Fig.1 Expression of HIF-1α in ovarian cancer

图2A 图2B

注：图2A为每组中20ng/mL SDF-1α 0、2、4、6和8h后各组中HIF-1α的mRNA水平；图2B为每组中加入SDF-1α分别0、1、10、20和50ng/mL后各组中HIF-1α的mRNA水平。

图2 SDF-1α诱导的HIF-1α在卵巢癌细胞株SKOV3中的表达水平

Fig.2 Expression level of HIF-1α induced by SDF-1α. in ovarian cancer cell line SKOV3

图3 各组细胞中HIF-1α的蛋白表达水平

Fig.3 Protein expression levels of HIF-1α in each cell group

2.4 p38丝裂原活化蛋白激酶在基质细胞衍生因子-1α/缺氧诱导因子-1α诱导的卵巢癌细胞迁移中的作用

进一步分析SDF-1α/HIF-1α诱导卵巢癌细胞迁移的作用机制，Western分析表明，SDF-1α诱导p38MAPK的活化，见图4A。当用p38MAPK通路抑制剂SB203580处理后，细胞中SDF-1α诱导的HIF-1α的表达水平明显受到抑制，见图4B。

注：图4A为各组细胞中pp38、p38的蛋白表达水平；图4B为各组细胞中HIF-1α的蛋白表达水平。

图4 pp38、p38及HIF-1α的蛋白表达水平

Fig.4 Protein expression levels of pp38, p38 and HIF-1α in each cell group

3 讨论

3.1 趋化因子CXCR及其受体

趋化因子CXC受体(CXCR)是Gt类趋化因子，定位于第4号染色体，是完整的膜蛋白，可与CXC趋化因子家族成员特异性结合。目前已经发现哺乳动物有7种趋化因子受体，分别被命名为CXCRl～CXCR7。CXCRl和CXCR2密切相关，CXCRl的配基是人类CXCL8[也称为白细胞介素(IL)-8]和CXCL6。CXCR2与CXCLl～CXCL7结合，CXCRl和CXCR2均表达在中性粒细胞表面，对中性粒细胞的趋化具有重要意义。CXCR3主要表达在T淋巴细胞和某些B淋巴细胞及自然杀伤细胞，细胞被激活后高表达，CXCR3有2种同种型：CXCR3-A和CXCR3-B，有3种高选择性配基：CXCL9、CXCLl0和CXCLl 1(IFN 7、7 IP-10和Mig)，7 IP-10和Mig是CXC趋化因子超家族的2个成员，IFN 7可以极大程度地上调它们的表达。7 IP-10和Mig是CXCR3的功能性激动剂。这两种蛋白对NK细胞和活化T细胞有很强的激活作用，还介导IFN 7和脂多糖的作用及介导T细胞依赖的抗肿瘤作用[2]，趋化因子拥有40～50种蛋白质的家族，CXCR与SDF-1α(基质细胞来源因子，又名CXCL12)均为GPCR家族成员[3]，广泛分部在中性粒细胞、T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、朗格汉斯细胞以及树突状细胞等造血细胞上。趋化因子对肿瘤发展进程的调控主要通过与其受体结合完成的，趋化因子授予G蛋白偶联的7次跨膜受体超家族。SDF-1α作为趋化因子家族成员之一，具有参与肿瘤细胞趋化性、血管生成及肿瘤转移的功能，已成为近些年来的研究热点。目前已有大量实验研究表明SDF-1α在多种癌症中均有表达，可通过与其相应的受体结合活化下游的信号通路，从而促进了癌症的侵袭、转移[4]。本研究前期实验已证明SDF-1α通过与其受体CXCR4结合形成SDF-1α/CXCR4生物轴诱导的卵巢癌细胞的侵袭性与αvβ6的表达相关，αvβ6整合素通过活化p38 MAPK及PI3K/Akt信号通路诱导下游uPA的表达，进而促进卵巢癌细胞的侵袭性[5]。

3.2 缺氧诱导因子-1α及其与基质细胞衍生因子-1α之间的关系

HIF-1α被认为是缺氧状态下广泛存在于哺乳动物和人体内的一种关键的转录因子，它可激活相关目的基因的转录，从而促进肿瘤的发生和发展。HIF-1α是由826个氨基酸组成，N端具有一个碱性螺旋-环-螺旋结构域(bHLH)和一个PAS(Per-ARNT-Sim)结构域，这两种结构域共同参与靶基因上的低氧反应元件结合，引起一系列反应，利于肿瘤在缺氧条件下的能量代谢和氧输送，为肿瘤的生长和转移提供基础。已有研究证明HIF-1α在卵巢癌组织中表达，提示HIF-1α对卵巢上皮癌的发生、发展起重要作用[6]。Mi-Kyoung Kim等[7]已证实，HIF-1α表达量的增加是依赖其上游的p38 MAPK信号通路的活化。

本实验设想SDF-1α是否可通过p38 MAPK-HIF-1α通路来调控卵巢癌细胞的迁移。结果显示：HIF-1α在卵巢癌患者组织中的阳性表达率明显增高，提示HIF-1α可能在卵巢癌的进程中起着重要作用；RT-PCR分析表明，SDF-1α刺激后可明显诱导人卵巢癌细胞SKOV3中HIF-1α的mRNA水平，表明SDF-1α能够促使卵巢癌细胞表达HIF-1α；Western分析表明，SDF-1α诱导p38 MAPK的活化，当用p38 MAPK通路抑制剂SB203580处理后，细胞中SDF-1α诱导的HIF-1α的表达水平明显受到抑制，提示SDF-1α通过激活p38 MAPK信号通路促进其下游的HIF-1α表达，从而促进卵巢癌细胞转移。本研究明确了SDF-1α通过p38 MAPK-HIF-1α通路促进卵巢癌细胞转移的机制，从而更好地为卵巢癌的靶向治疗提供新的思路，对临床诊疗起重要指导意义。

[1]Ceradini D J, Kulkarni A R, Callaghan M J,etal.Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxic gradientsthrough HIF-1 induction of SDF-1[J].Nat Med,2004,10(8):858-864.

[2]薛刚,黄静,张慧芹,等.三叶因子3和SDF-1/CXCR4生物轴在甲状腺乳头状癌中的表达及临床意义[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2014,28(2):108-112.

[3]易良,卞修武.趋化因子及其受体在肿瘤血管生长中的作用及意义[J].国际病理科学与临床杂志,2006,26(2):116-118.

[4]Heinrich E L, Lee W, Lu J,etal.Chemokine CXCL12 activates dual CXCR4 and CXCR7-mediated signaling pathways in pancreatic cancer cells[J].Journal of Translational Medicine,2012,10(1):68.

[5]XUE Bao-yao, WU Wei-guang, HUANG Kan,etal.Stromal cell-derived factor-1(SDF-1) enhances cells invasion by αvβ6 integrin-mediated signaling in ovarian cancer[J].Mol Cell Biochem,2013,380(1-2):177-184.

[6]陈素琴,高立亚,张英辉,等.卵巢上皮性肿瘤组织中HIF-1α与VEGF的表达及意义[J].临床与实验病理学杂志,2005,21(6):669-672.

[7]Mi-Kyoung Kim, Hyun-Joo Park, Yong-Deok Kim,etal.Hinokitiol increases the angiogenic potential of dental pulp cells through ERK and p38MAPK activation and hypoxia-inducible factor-1α(HIF-1α) upregulation[J].Arch Oral Biol,2014,59(2):102-110.

[专业责任编辑：安瑞芳]

Stromal cell-derived factor-1 alpha(SDF-1α) enhances cells invasion by p38MAPK-HIF-1α mediated signaling in ovarian cancer

XUE Bao-yao, ZHAO Jing, ZHANG Xi-yuan, JIANG Xia, ZHOU Zhuo, YU Yue-cheng

(DepartmentofObstetricsandGynecology,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,ShaanxiXi’an710032,China)

Objective To observe the role and mechanism of hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) in ovarian cancer cell migration regulated by stromal cell-derived factor-1 alpha (SDF-1α). Methods The expression of HIF-1α in cervical cancer was analyzed by immunohistochemistry. HIF-1α siRNA was transfected into ovarian cancer cell line SKOV3, and then treated with SDF-1α and SDF-1α+SB203580, respectively. The expression levels of HIF-1α and p38MAPK were confirmed by RT-PCR and western blotting. Results Immunohistochemical analysis showed that the expression of HIF-1α in ovarian cancer tissues was overexpressed, and that at the same time SDF-1α could induce the expression of mRNA and protein levels in HIF-1α. After transfected by HIF-1α siRNA, the HIF-1α expression level decreased obviously. When treated by SB203580, the expression level of HIF-1α induced by SDF-1α decreased significantly. Conclusion SDF-1α can regulate cells invasion by p38MAPK-HIF-1α mediated signaling in ovarian cancer. Therefore, this study will provide a new research direction for prevention and treatment of ovarian cancer.

stromal cell-derived factor-1 alpha(SDF-1α)；MAPK pathway；hypoxia inducible factor-1α；ovarian cancer；cells invasion

2014-07-09

薛宝瑶(1988-)，女，主治医师，硕士研究生，主要从事妇科肿瘤的研究。

于月成，副教授/副主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.02.025

R737.33

A

1673-5293(2015)02-0243-03