陕西地区宫颈癌和细胞学正常妇女HR-HPV病毒流行谱分析

杨 波，曹 萌，齐静娴，李 娇，朱广侠，张冠军，王一理

(1.西安交通大学医学部 基础医学院癌症研究所，陕西 西安710061；2.西安交通大学医学部第一附属医院肿瘤研究中心，陕西 西安710061；3.西安交通大学医学部第一附属医院妇产科，陕西 西安710061)

陕西地区宫颈癌和细胞学正常妇女HR-HPV病毒流行谱分析

杨 波1，2，曹 萌1，2，齐静娴1，2，李 娇3，朱广侠3，张冠军2，王一理1，2

(1.西安交通大学医学部 基础医学院癌症研究所，陕西 西安710061；
2.西安交通大学医学部第一附属医院肿瘤研究中心，陕西 西安710061；
3.西安交通大学医学部第一附属医院妇产科，陕西 西安710061)

目的 分析陕西地区高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)阳性，但宫颈细胞学正常和宫颈癌患者HPV病毒谱。方法 利用PCR基因扩增方法，检测宫颈脱落细胞中8种HR-HPV DNA(包括HPV16、18、31、33、35、45、52、58等)并行细胞病理学检测。对1 005例HR-HPV阳性但宫颈细胞学正常标本及160例经组织病理学证实宫颈癌标本进行HPV感染谱对比分析。结果 正常细胞学组与宫颈癌组的HR-HPV型别分布除HPV35、45外，其余型别HPV16、18、31、33、52、58等差异均有统计学意义(χ2值分别为465.147、110.288、9.261、4.496、30.155、46.559，均P<0.05)；正常细胞学组中HPV多为单一感染，而宫颈癌组中多重HPV感染较为常见。单一感染均以HPV16最为常见，在正常细胞学组和宫颈癌组分别占34.9%和37.6%。双重感染在正常细胞学组以HPV16合并HPV52最为常见(占2.9%)；而宫颈癌组则以HPV16合并HPV18最为常见(占20.8%)。结论 正常细胞学组HPV感染谱与宫颈癌组中相同HPV型别分布的差异均有助于理解HPV致癌机理以及预防性HPV疫苗的设计。

正常细胞学；子宫颈癌；HPV基因型；陕西地区

高危型人乳头瘤病毒(high risk human popillomavirus，HR-HPV)感染是宫颈癌(ICC)的始动因素已经成为共识，宫颈癌在世界范围内是仅次于乳腺癌的妇女第2位恶性肿瘤。在有些发展中国家，宫颈癌甚至是育龄妇女的主要死因[1]。基于HR-HPV感染与宫颈癌的关系，HR-HPV检测结合宫颈脱落细胞学已经成为常规的宫颈癌筛查手段，特别是对HR-HPV感染患者，应作为重点追踪观察的对象。这一策略已经取得了肯定的经济效益和社会效益[2]。已知绝大多数人乳头瘤病毒(HPV)感染可自行消退，仅持续性感染的HR-HPV可能引发肿瘤，比较不同级别宫颈上皮内瘤变(CIN)与宫颈癌时HR-HPV感染谱的变化已有较多报道，当形成高级别CIN至宫颈癌，HR-HPV感染谱的变化较为接近[3-4]，在全球范围内，HPV16作为最流行的HR-HPV型别，无论是在宫颈细胞学正常人群或不同级别CIN直至浸润性宫颈癌，感染频数居最高，但其他HR-HPV在不同人群不同疾病状态则变化较大[5-7]。比较分析宫颈细胞学正常但HR-HPV阳性病毒谱与宫颈癌组织中HR-HPV病毒谱的差异和变化，有助于了解HR-HPV致癌机理以及预防性疫苗的设计。陕西地区曾是宫颈癌高发区，本研究分析了陕西地区HR-HPV在正常的宫颈脱落细胞学和宫颈癌标本中的状况，报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源

宫颈脱落细胞标本取自2012年1月至2013年12月西安交通大学第一附属医院门诊籍贯为陕西地区妇女，样本分为两份，一份利用液基细胞学技术(TCT)制片、巴氏染色，细胞病理学观察；另一份保存于4℃，24小时内进行HPV DNA检测。根据基因检测、细胞病理学结果，收集细胞学正常但HR-HPV阳性标本共计1 005例作为正常细胞学组。宫颈癌组是来自西安交通大学医学院第一附属医院病理科经切片证实的160例进展期的人宫颈鳞状细胞癌组织活检标本。

1.2 人乳头瘤病毒基因检测

1.2.1 正常细胞学组人乳头瘤病毒基因检测

采用凯普HPV分型诊断系统(潮州)进行宫颈脱落细胞HPV基因分型，实验过程根据操作指南进行。

1.2.2 宫颈癌组人乳头瘤病毒基因检测

1.2.2.1 提取组织 每例样本收集约25～100mg石蜡切片组织按照试剂盒操作说明提取宫颈癌组织基因组DNA(DP304 北京天根公司)，溶于TE缓冲液中待用。

1.2.2.2 人乳头瘤病毒检测型特异性引物设计 本研究采用E6作为扩增的靶基因，以β-globin 作为内参照以检测DNA的完整性。HPV共有引物(GP5+/GP6+)和型特异性引物(E6)用于检测8种HR-HPV(16、18、31、33、35、45、52、58)的分型。引物设计利用primer3软件参照National Center for Biotechnology Information(NCBI) website http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.提供的碱基序列完成，引物合成由奥康生物技术公司完成，见表1。

1.2.2.3 PCR扩增特定人乳头瘤病毒基因片段 参照试剂盒说明常规进行宫颈癌组织HPV基因PCR扩增。PCR预混溶液(PCRMaster Mix，北京天根)25μL加入模板DNA2μL，反应条件如下：起始变性(95℃，5分钟)，变性(94℃，30秒)，退火30秒，延伸(72℃，30秒)共35个循环。取扩增产物经2%琼脂糖电泳后EB染色进行观察。

1.3 统计学方法

所有数据均采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

表1 HPV分型的引物序列

2 结果

2.1 高危人乳头瘤病毒型别在正常细胞学和宫颈癌组织中的分布

正常细胞学组HR-HPV型别分布依次为HPV16(43.4%)、HPV52(25.7%)、HPV58(19.9%)、HPV18(9.8%)、HPV31(8.4%)、HPV33(7.7%)、HPV45(1.5%)、HPV35(1.2%)；将宫颈癌组的160例标本中的149例β-globin阳性标本纳入本研究，其中19例β-globin阳性标本未检测出HPV DNA，认为HPV阴性，HR-HPV检出率为87.2%。宫颈癌组HR-HPV型别分布则依次为HPV16(73.2%)、HPV18(41.6%)、HPV58(11.4%)、HPV52(5.4%)、HPV33(2.7%)、HPV45(2.0%)、HPV31%(1.3%)、HPV35(0)。两组相比，除HPV35、45外，其余HR-HPV型别差异均有统计学意义(均P<0.05)，见表2。

虽然HPV52频数在正常细胞学组高达25.7%，但在宫颈癌组则降低至5.4%；HPV18从9.8%升至41.6%；HPV58虽在宫颈癌组有所降低，但降低的幅度远低于HPV52。

表2 8种常见HR-HPV基因型在正常细胞学组和宫颈癌组分布比较[n(%)]

Table 2 Distribution of 8 common HR-HPV genotypes in normal cytology group and cervical cancer group[n(%)]

2.2 高危人乳头瘤病毒型别感染在正常细胞学和宫颈癌组织中的状态

本研究结果显示正常细胞学组单一感染较为常见，HPV31、33、52、58均高于宫颈癌组，差异均有统计学意义(均P<0.05)；但多重感染在宫颈癌组明显高于正常细胞学组，两组中各型HR-HPV频数及感染状态见表3。

表3 正常细胞学组和宫颈癌组中各型HR-HPV频数及感染状态[n(%)]

Table 3 Frequency and infection status of HR-HPV types in normal cytology group and cervical cancer group[n(%)]

(转下表)

(续上表)

HR-HPV组合正常细胞学组(n=1005)宫颈癌组(n=149)χ2PHPV16,5229(2.9)3(2.0)0.3660.787HPV16,5815(1.5)4(2.7)0.6400.709HPV18,5212(1.2)1(0.7)0.3191.000HPV18,583(0.3)3(2.0)7.3780.031HPV16,18,5202(1.3)13.3340.017HPV16,18,5809(6.0)61.1870.000HPV16,52,583(0.3)00.4461.000HPV18,52,581(0.1)00.1481.000主要HR-HPV多重感染(合计)73(7.3)53(35.6)106.8990.000其它HR-HPV多重感染(合计)79(7.9)6(4.0)2.7950.095多重HR-HPV感染(总计)152(15.1)59(39.6)52.0160.000

3 讨论

临床上HPV筛查重要的是HR-HPV，其他型别因与宫颈癌无关而不用于宫颈癌筛查，低危HPV型别检测对宫颈癌筛查和异常细胞学妇女的评估没有临床意义。HR-HPV DNA结合宫颈细胞学检测已成为公认的常规宫颈癌筛查策略，而HR-HPV DNA检测在确定患者包括随访间隔等临床处理方式中起决定性作用[2]。目前推荐，在有条件的地区进行宫颈细胞学与HPV双筛查，30岁以上的妇女普查，两种检查均阴性，每3年复查1次，若HPV阳性，则每年复查1次。

3.1 各型高危人乳头瘤病毒在两组中分布频数不同

已有报道，HR-HPV在轻度CINⅠ和浸润性宫颈癌中频数不同[3]，即便是中度CINⅡ、重度CINⅢ和宫颈癌之间，HR-HPV谱也表现不同。如欧洲筛查结果显示，CINⅢ最常见的HR-HPV型别是HPV16/33/31(59.9/10.5/9.0%)，而宫颈癌最常见的HR-HPV型别则为HPV16/18/45(63.3/15.2/5.3%)[4]。本研究选择了宫颈细胞学正常而HR-HPV型别阳性标本，对照宫颈癌标本中HR-HPV型别差异，结果显示，HPV16感染在两组标本中均列为第1，但其他型别差异较大，HR-HPV型别谱在不同人群、不同病变类型中的差异现象与以往的报道相似[7]。值得注意的是，HPV16以外的其他HR-HPV在两类人群中变化的差异不同。本研究结果显示，HPV18从9.8%升高至41.6%，HPV58从19.9%降至11.4%，HPV52在正常细胞人群中高居第2，比例高达25.7%，但在宫颈癌组则降低至5.4%。英国的资料显示，HPV18、33、45、58型在宫颈癌略有下降，HPV52在宫颈癌略有升高，而HPV31则明显升高[3]。

3.2 高危人乳头瘤病毒在两组中的感染状态差异

当考虑HR-HPV感染状态(即单一感染拟或多重感染)在两组中的分布，可以看出二者明显的区别，除了单一HPV16、18感染在宫颈正常细胞学组低于宫颈癌组，而其他HR-HPV型别单一感染频数均明显高于宫颈癌组，HPV52、58单一感染几乎未见于宫颈癌组。但在宫颈癌组，多重感染则明显多于宫颈正常细胞学组。多重感染主要是HPV16、18与其他HR-HPV型别的组合，HR-HPV型别在正常或低级别细胞病变和浸润性宫颈癌组织中频数的变化，与以往的报道类似[8]，这一结果不但说明HPV16、18是关键的高危型别，而且提示其他被认定的高危型别在致癌过程中的独立性需要进一步探讨。特别是中国人群中HPV52在宫颈细胞正常组感染频数很高而受到重视，但在浸润性宫颈癌时频数很低却很少强调，其实这种变化提示其较低的致癌潜能。

综上所述，HR-HPV在宫颈细胞学正常和浸润性宫颈癌的频数分布的变化以及感染的状态，一定程度上反映了HR-HPV在宫颈癌发生中的作用，充分了解这种变化，有助于理解HPV致癌机理以及预防性HPV疫苗设计。

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[专业责任编辑：李 旭]

更 正

本刊发表于2014年第25卷第6期第954～957页《孕期体操运动对不良症状改善的效果》一文中通讯作者缺如，现补充更正为：首都医科大学公共卫生学院杨兴华教授。

High risk human papillomavirus prevalence in women with normal cytology and with cervical cancer in Shaanxi area

YANG Bo1,2, CAO Meng1,2, QI Jing-xian1,2, LI Jiao3, ZHU Guang-xia3, ZHANG Guan-jun2, WANG Yi-li1,2

(1.InstituteforCancerResearchofSchoolofBasicMedicalScience,HealthScienceCenterofXi’anJiaotongUnivertsity,
ShaanxiXi’an710061,China; 2.CenterofCancerResearchoftheFirstAffiliatedHospital,
HealthScienceCenterofXi’anJiaotongUniversity,ShaanxiXi’an710061,China;
3.DepartmentofGynecologyandObstetrics,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,ShaanxiXi’an710061,China)

Objective To analyze the spectrum of HPV in women with normal cytology and cervical cancer with high risk human papillomavirus (HR-HPV) in Shaanxi area. Methods HPV16, 18, 31, 33, 35, 45, 52, 58 DNA in cervical exfoliated cells were detected by PCR. Pap tests were performed for cytopathological analysis. Infection spectrum was analyzed and compared between 1 005 cases with positive HR-HPV and normal cytology and 160 cases of cervical cancer. Results The distribution of HPV16, 18, 31, 33, 52 and 58 was significantly different between normal cytology group and cervical cancer group except for HPV35 and 45 (χ2 value was 465.147, 110.288, 9.261, 4.496, 30.155 and 46.559, respectively, allP<0.05). Infection with single HPV type was more common in the normal cytology group, while infection with multiple HPV types were frequently found in the cervical cancer group. HPV16 was the most prevalent genotype detected in two groups, and the infection rate of it was 34.9% and 37.6% respectively in the normal cytology group and cervical cancer group. Considering multiple infection, HPV16 and 52 were more frequently found in the normal cytology group (2.9%), while in the cervical cancer group the most prevalent multiple infection pattern were HPV16 and 18 (20.8%). Conclusion The difference in the distribution of HPV types found both in normal cytology group and cervical cancer group is helpful for understanding HPV carcinogenic mechanism and designing of prophylactic vaccine.

normal cytology；cervical cancer；human papillomavirus genotype；Shaanxi area

教育部博士点基金资助项目(No.20070698097)

杨 波(1983-)，女，在读硕士，主要从事肿瘤免疫方面的研究。

王一理，教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.02.023

R711.74

A

1673-5293(2015)02-0237-03

[投稿日期]2015-01-19