PB和TPM对未成熟脑大鼠远期学习记忆的影响及刺五加的保护作用

葛利吉，杨 琳，韩 玲，刘 宇，齐薛浩

(1.陕西中医学院，陕西 咸阳712000；2.西安交通大学医学院第二附属医院，陕西 西安710000；3.西安市儿童医院，陕西 西安710000)

PB和TPM对未成熟脑大鼠远期学习记忆的影响及刺五加的保护作用

葛利吉1，杨 琳2，韩 玲1，刘 宇2，齐薛浩3

(1.陕西中医学院，陕西 咸阳712000；2.西安交通大学医学院第二附属医院，陕西 西安710000；3.西安市儿童医院，陕西 西安710000)

目的 通过短期给予新生幼鼠不同抗癫痫药，观察苯巴比妥(PB)和托吡酯(TPM)对幼鼠远期学习记忆功能的影响及刺五加的保护作用。方法 实验动物分两批：第1批3窝健康3日龄Sprague-Dawley(SD)大鼠30只(雌、雄不分)随机分为3组，生理盐水对照组10只、苯巴比妥组10只、苯巴比妥+刺五加组10只；第2批3窝健康3日龄Sprague-Dawley(SD)大鼠30只(雌、雄不分)随机分为3组，生理盐水对照组10只，托吡酯组10只，托吡酯+刺五加组10只。对照组给予生理盐水10mL·kg-1·d-1，苯巴比妥组：苯巴比妥62.5mg·kg-1·d-1，苯巴比妥+刺五加组：苯巴比妥62.5mg·kg-1·d-1，刺五加干粉5.6g·kg-1·d-1。托吡酯组：40mg·kg-1·d-1，托吡酯+刺五加组：托吡酯40mg·kg-1·d-1，刺五加干粉5.6g·kg-1·d-1。每日称重后腹腔注射，连续3天。正常饲养至1月龄，最后各组选取8只大鼠，参加水迷宫测试。结果 苯巴比妥干预组大鼠寻找水下平台的潜伏期较对照组明显延长，均存在显著性差异(t=-3.542，P=0.005)；穿越有效区次数较对照组减少(t=3.352，P=0.005)。加用刺五加保护后，与对照组比较，潜伏期(t=-1.313，P=0.210)及穿越有效区次数(t=0.051，P=0.128)均无显著性差异。托吡酯干预组大鼠与对照组比较潜伏期(t=-1.920，P=0.075)、穿越有效区次数(t=1.915，P=0.076)；托吡酯组与托吡酯+刺五加组比较潜伏期(t=-0.597，P=0.560)、穿越有效区次数(t=1.660，P=0.119)，均无显著性差异。结论 未成熟脑短期应用苯巴比妥损害远期学习记忆，刺五加具有保护作用，短期应用中等剂量的托吡酯不会对未成熟脑产生远期学习记忆障碍。

苯巴比妥；托吡酯；刺五加；未成熟脑；学习记忆

惊厥是临床常见的急症，是小儿时期常见的急重病证，临床以抽搐伴神志不清为主要症状。流行病学研究显示，全球约有1%～2%的人一生中至少有1次惊厥发作，生后1岁以内，尤其新生儿时期是发病的高峰，这一时期神经细胞对内外界环境的变化极为敏感[1]。因此，惊厥的预防和治疗是必要的，而目前抗癫痫药仍是控制小儿惊厥的首选药物[2]。本实验应用短期苯巴比妥(PB)及托吡酯(TPM)的两种抗癫痫药幼鼠模型，及抗癫痫药加用刺五加保护模型，通过Morris水迷宫实验，测试幼鼠学习和记忆能力的变化，从行为学上来推断短期内分别应用两种抗癫痫药是否会对未成熟脑产生认知损害，以及加用刺五加后对认知是否有改善作用。

1 材料与方法

1.1 材料

生后3天清洁级健康未成熟(Sprague-Dawley，SD)窝鼠，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。苯巴比妥粉针剂(批号140613)、托吡酯(批号H20020555)、刺五加喷雾干燥粉(批号：20080401)、生理盐水(批号G114071604)。Morris水迷宫实验装置由西安交通大学医学院机能中心提供。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组情况

实验分两批进行：第1批苯巴比妥干预，生后3d未成熟SD窝鼠3窝，随机分为苯巴比妥组、苯巴比妥+刺五加组、生理盐水对照组各10只；第2批托吡酯干预，生后3d未成熟SD窝鼠3窝，托吡酯组、托吡酯+刺五加组、生理盐水对照组各10只。

按照分组给药，对照组：生理盐水10mL·kg-1·d-1。依据Meeh-Rubner的人与大鼠间药物剂量体表面积换算公式及相关文献[3]，最终确定用药剂量分别是：苯巴比妥62.5mg·kg-1·d-1(相当于临床抢救剂量10mg·kg-1·d-1，托吡酯40mg·kg-1·d-1(相当于临床抢救剂量7mg·kg-1·d-1)，刺五加干粉5.6g·kg-1·d-1。分别一次性腹腔注射。每日称重后，根据体重调整药物剂量。每日同一时间给药，连续给药3d，正常饲养，第21d断奶分笼，第30d每组各选取8只参加Morris水迷宫测试。

1.2.2 实验装置情况

Morris水迷宫MT200USB跟踪系统，它包括一个圆形乳白色水池，直径120cm，高50cm；池壁上标有东南西北4个入水点，将水池等分为4个象限；目标象限的固定位置放一直径9cm、高27cm的圆形乳白色平台，水面高于平台1.5cm，整个实验期间平台位置保持不变；水中加1kg奶粉，温水冲开，以隐藏平台，水温保持在22±0.5℃，用苦味酸在实验动物的头部和背部涂成较大相连的区域，便于摄像；实验期间迷宫外有足够的参照物，且始终保持不变。迷宫上方安置带有显示系统的摄像机，同步记录动物游泳轨迹，Morris水迷宫数据采集和分析软件记录相关数据及图象结果。

1.2.3 水迷宫行为测试

参照罗小泉等[4]水迷宫试验方法，测试包括定位航行试验和空间探索试验两个部分，①定位航行试验：用于对空间位置的学习能力，第30d正式实验，每只大鼠每天测验8次，上午4次，下午4次，连续4d。测试大鼠面向池壁没入水中，其入水点在东西南北随机选取。记录大鼠游上平台所需时间(即潜伏期)，每次大鼠游上平台，待其在平台上停留30s后取出动物，再进行下一只实验。若潜伏期超过120s则人工将动物引导至平台并停留30s，且该次测验的潜伏期记录为120s。取8次逃避潜伏期平均值为每天的逃避潜伏期；②空间探索：用于对平台空间位置的记忆能力。于第35d上午撤除平台，将大鼠头向平台对侧象限宫壁的中点放入水中，记录大鼠120s内穿过原平台象限及位置的次数，和在原平台象限探索时间与总时间(120s)的百分比，原平台象限与120s内游泳总路程之比，以此评价动物对已获取信息的存储、记忆能力。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 苯巴比妥干预各组情况

各组大鼠寻找平台的潜伏期随着实验进行逐日递减，见图1。苯巴比妥组大鼠较对照组大鼠寻找水下平台的潜伏期明显延长(t=-3.542，P=0.005)，穿越有效区次数较对照组减少(t=3.352，P=0.005)，差异均存在统计学意义；苯巴比妥组120s内平台象限路程与总路程之比小于对照组(t=1.275，P=0.223)，但差异无统计学意义。

苯巴比妥组与苯巴比妥+刺五加组比较，苯巴比妥干预潜伏期明显延长(t=2.378，P=0.016)，穿越有效区次数减少(t=-2.640，P=0.018)，差异均存在统计学意义；苯巴比妥组120s内平台象限路程与总路程之比小于苯巴比妥+刺五加组(t=-0.604，P=0.556)，但差异无统计学意义。

苯巴比妥+刺五加组与对照组比较，潜伏期(t=-1.313，P=0.210)、穿越有效区次数(t=0.051，P=0.128)、120s内平台象限路程与总路程之比(t=0.785，P=0.446)，各项指标差异均无统计学意义，见表2。

Table 1 Comparison of experiment results of Morris water maze in PB intervention groups

图1 苯巴比妥干预各组大鼠每天逃避潜伏期均值线形图

Fig.1 Line diagram of average escape incubation period every day of PB intervention groups

2.2 托吡酯干预各组情况

各组大鼠寻找平台的潜伏期随着实验进行逐日递减，见图2。托吡酯组大鼠寻找水下平台的潜伏期大于对照组(t=-1.920，P=0.075)，穿越有效区次数较对照组减少(t=1.915，P=0.076)，120s内平台象限路程与总路程之比小于对照组(t=0.838，P=0.416)，但差异均无统计学意义。

托吡酯组与托吡酯+刺五加组比较，潜伏期(t=1.521，P=0.150)、穿越有效区次数(t=-0.675，P=0.511)、120s内平台象限路程与总路程之比(t=-0.388，P=0.704)差异均无统计学意义。

托吡酯+刺五加组与对照组比较，潜伏期(t=-0.597，P=0.560)、穿越有效区次数(t=1.660，P=0.119)，120s内平台象限路程与总路程之比(t=0.721，P=0.482)差异均无统计学意义，见表2。

Table 2 Comparison of experiment results of Morris water maze in TPM intervention groups

图2 托吡酯干预各组大鼠每天逃避潜伏期均值线形图

Fig. 2 Line diagram of average escape incubation period every day of TPM intervention groups

3 讨论

新生儿期是大脑的快速发育期,在此期间大脑内大量神经细胞进行增殖、分化、迁移、突触生成以及细胞间网络建成等生长发育,这时期脑神经细胞最易受内外界各种不良因素的影响[5]。认知功能是指人们熟练运用知识的能力，包括学习新知识的能力和从丰富的知识库中追忆知识的能力，如计算能力、抽象概括能力、判断事物之间的相似性与差别(分析和运用知识)的能力等，它是判断脑功能的一个主要指标[6]。海马是学习记忆的关键部位，Morris水迷宫是研究与海马功能直接相关的空间学习记忆的方法，可客观反映动物的空间学习记忆能力[4]。

3.1 苯巴比妥对未成熟脑学习记忆的影响及刺五加的保护作用

苯巴比妥作为传统的抗癫痫药一直广泛应用于临床。行为学研究发现围产期暴露于苯巴比妥的大鼠在八臂迷宫试验、水迷宫试验等空间学习实验中显示能力下降[7]。研究表明即使是单次给予大剂量苯巴比妥也会改变小脑PCs的突触功能，可能对幼鼠的学习和认知功能产生不良影响[8]。本实验结果显示，在Morris水迷宫实验中，苯巴比妥干预组大鼠较对照组及苯巴比妥+刺五加组大鼠平均逃避潜伏期显著延长，穿越平台象限有效区次数明显减少，证明本次试验中苯巴比妥干预后大鼠学习记忆功能受到损害，与以往研究结果一致。平台象限路程与总路程之比较对照组小，但差异无统计学意义，考虑可能与样本量少及实验中的误差有关。徐耀等[9]的实验结果表明，刺五加皂甙可能通过抑制海马区的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达，而改善慢性脑缺血大鼠认知功能。郭冷秋等[10]对记忆障碍大鼠的研究表明，刺五加能明显增强SD大鼠的记忆能力(寻找时间缩短，错误次数减少，认知率提高)，此作用可能与增强大鼠海马区突触可塑性有关。本实验中苯巴比妥+刺五加组大鼠与对照组大鼠比较，平均逃避潜伏期及穿越平台象限有效区次数差异无统计学意义，表明刺五加对未成熟脑起到了保护作用。

3.2 托吡酯对未成熟脑学习记忆的影响

托吡酯是吡南果糖氨基磺酸酯化合物，通过多种机制抗癫痫，是治疗难治性癫痫的有效药物之一，目前已经作为新型抗癫痫药物在临床中广泛使用。托吡酯可用于治疗部分性和全面性癫痫，尤其是难治性癫痫，临床疗效肯定。部分患者有记忆力下降、注意力不集中、言语流畅性降低、找词困难等认知障碍[11]。李晶等[12]的研究发现可引起健康幼鼠学习记忆能力的损害，长程使用学习记忆能力损害较短程组更为明显，与之相一致的是光镜下托吡酯长程组海马锥体细胞出现胞质浓缩、细胞膜皱缩等形态学改变，而托吡酯短程组及对照组无此现象，说明托吡酯对学习记忆能力损害可能与用药时程有一定的关系。也有研究发现，生后7d的SD大鼠给予灌胃40mg/kg,连续给药28d，35d时观察海马背侧齿状回颗粒细胞增殖、成熟及分化与正常对照组差异均无统计学意义[13]。除了有效的抗惊厥作用外，有研究证明托吡酯可以通过BDNF/TrKB依赖ERK通路的激活而衰减谷氨酸的毒性，起到保护海马神经的作用[14]。研究还发现托吡酯在新生儿缺血性脑损伤中具有神经保护的作用，可以适度地提高癫痫新生儿的视觉-空间记忆能力[5]。有研究还发现，托吡酯的治疗与认知功能障碍之间存在一定的剂量关系，低剂量(20mg/kg)、中剂量(40mg/kg)对学习记忆的影响不明显，高剂量(80mg/kg)明显抑制了癫痫大鼠的学习记忆能力[15]。本实验结果显示，与正常对照组比较，托吡酯干预组大鼠平均逃避潜伏期无显著性差异，120s内平台象限路程与总路程之比、穿越平台象限次数差异无统计学意义。证明在未成熟脑短期使用中等剂量的托吡酯不会对未成熟脑远期认知产生损害。对未成熟脑长期大剂量使用托吡酯是否会产生远期的认知损害，出现行为学上的改变，有待进一步的研究。

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[专业责任编辑：刘小红]

Influence of Phenobarbital and Topiramate on long-term learning and memory in Rats with immature brain and the protection effect of Acanthopanax

GE Li-ji1, YANG Lin2, HAN Ling1, LIU Yu2, QI Xue-hao3

(1.ShaanxiUniversityofChineseMedicine,ShaanxiXianyang712000,China; 2.SecondAffiliatedHospitalofMedicalCollege,
Xi’anJiaotongUniversity,ShaanxiXi’an710000,China; 3.Children’sHospitalofXi’anCity,ShaanxiXi’an710000,China)

Objective To observe the influence of Phenobarbital (PB) and Topiramate (TPM) on long-term learning and memory of newly-born rats by short-term administration and the protection effect of Acanthopanax. Methods There were two batches of rats. Among the first batch, 30 3-day old healthy Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into 3 groups, control group, PB group and PB combined with Acanthopanax group. Among the second batch, 30 3-day old healthy Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into 3 groups with 10 rats in each, control group, TPM group and TPM combined with acanthopanx group. Hypertonic saline (10mL·kg-1·d-1) was given to the control group, PB group was injected with PB (62.5mg·kg-1·d-1), and PB (62.5mg·kg-1·d-1) and Acanthopanax (5.6g·kg-1·d-1)were injected to PB combined with Acanthopanax group. TMP was injected to TMP group with the dose of 62.5mg·kg-1·d-1, and TMP combined with Acanthopanax group were given 62.5mg·kg-1·d-1of TMP and 5.6g·kg-1·d-1of Acanthopanax. The rats were injected after weighed for three continuous days. They were regularly fed till they were one month old. Finally 8 out of each group were selected to attend the game of Morris water maze. Results The incubation period for searching underwater platform in PB group was longer than the control group, and the difference was significant (t=-3.542,P=0.005). The times passing through the effective area reduced in PB group compared with the control group (t=3.352,P=0.005). However, after adding Acanthopanax, the incubation period (t=1.313,P=0.210) and the times passing through the effective area (t=0.051,P=0.128) had no significant difference from the control group. The incubation period for searching underwater platform in TPM group was significantly longer than the control group (t=-1.920,P=0.075), but the times passing through the effective area was less than the control group (t=1.915,P=0.076). However, TPM group was not significantly different from TPM combined with Acanthopanax group in incubation period (t=-0.597,P=0.560) and the times passing through the effective area (t=1.660,P=0.119). Conclusion Short-term use of PB in immature brain will damage long-term learning and memory, while Acanthopanax has protective effect. Short-term use of moderate dose of TPM in immature brain will not produce long-term learning and memory damage.

Phenobarbital (PB)；Topiramate (TPM)；Acanthopanax；immature brain；learning and memory

2014-12-08

国家自然科学基金资助项目(30973224)；医院人才培养专项科研基金资助项目[RC(XM)200908]；陕西省科技公关资助项目[2006k15-G1(2)]

葛利吉(1977-)，女，主治医师，在读硕士研究生，主要从事小儿学习记忆的研究。

杨 琳，副教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.02.014

R720.597

A

1673-5293(2015)02-0207-03