IGFBP-3在白藜芦醇抑制胃癌细胞增殖过程中的作用

孙海斌，何晓燕，马梅

(郑州大学第五附属医院病理科，郑州 450000)

IGFBP-3在白藜芦醇抑制胃癌细胞增殖过程中的作用

孙海斌，何晓燕，马梅

(郑州大学第五附属医院病理科，郑州 450000)

目的 研究在白藜芦醇(Res)抑制胃癌细胞增殖过程中，胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)表达的变化。方法 噻唑蓝(MTT)法测定Res对BGC-823细胞增殖的抑制程度，实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western blot技术检测Res处理后BGC-823细胞中IGFBP-3表达变化，siRNA技术沉默IGFBP-3基因表达，MTT法观察Res对BGC-823细胞增殖的影响，流式细胞技术测定各组细胞凋亡率。结果 Res能够抑制BGC-823生长，经20，40，80，160 μmol·L-1Res处理后，细胞存活率分别为(82.35±10.65)%，(74.30±12.36)%，(62.80±14.66)%，(50.75±11.14)%。Res刺激后，IGFBP-3表达水平升高，与对照组比较，IGFBP-3 mRNA水平增高2.96 倍(P<0.05)， IGFBP-3蛋白水平变化与其mRNA一致。siRNA技术沉默IGFBP-3表达后，160 μmol·L-1Res刺激BGC-823细胞，细胞存活率下降(78.5±9.86)%，但高于同浓度下Res刺激的未经IGFBP-3沉默的BGC-823细胞(P<0.05)。IGFBP-3沉默后，160 μmol·L-1Res处理后BGC-823细胞凋亡率(20.13±9.12)%，明显低于未经IGFBP-3沉默的BGC-823细胞[(35.48±11.12)%]，且差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Res可以抑制BGC-823细胞增殖，促进其凋亡。该机制涉及IGFBP-3高表达。

白藜芦醇；胰岛素样生长因子结合蛋白-3；BGC-823细胞

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，具有容易转移、预后较差的特点。目前胃癌的治疗方式主要包括手术、化学治疗(化疗)、放射治疗、靶向治疗[1]。但前3种治疗方式对机体损伤较大，因此，高效、具有选择性、对机体损伤小的靶向治疗倍受关注。在此背景下，针对特定信号通路或者转录因子且可以诱导肿瘤细胞凋亡的药物越来越受重视[2]。白藜芦醇(resveratrol，Res)是从植物白藜芦的根中提取的酚类物质，也存在于葡萄等植物中，具有保护神经、保护血管、抗氧化、抗炎、抗癌等功能[3-4]。研究表明，Res可以抑制胃癌细胞、胰腺癌细胞、鼻咽癌细胞增殖[5-7]，但其抑制细胞增殖的具体机制尚不明确。胰岛素样生长因子结合蛋白-3(insulin-like growth factor binding protein-3，IGFBP-3)是胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)特异性结合蛋白，具有调节细胞增殖的作用。既往研究表明，IGFBP-3可以促进细胞凋亡[8]，但IGFBP-3与胃癌细胞凋亡关系的报道笔者较少见到。笔者在本研究中假设Res抑制胃癌细胞BGC-823增殖的机制与IGFBP-3有关，探讨Res处理后BGC-823细胞中IGFBP-3表达水平的变化。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 Res(Sigma公司，批号：R5010，纯度>99%)，BGC-823细胞株(购自中国科学院上海生命科学研究所，批号：TCHu 45)。RPMI-1640培养液(赛默飞世尔生物化学制品有限公司，批号：31800022)，胎牛血清(杭州四季青生物制品有限公司，批号：sc-224480)，噻唑蓝(methyl thiazoly tetrazolium，MTT)试剂(Sigma公司，批号：M2128)，RNAiso Plus Kit[宝生物工程(大连)有限公司，批号：D9108A]，PrimeScript®RTreagent Kit(宝生物工程有限公司，批号：RR037Q)，凋亡检测试剂盒(Sigma公司，批号：APOAF-20TST)，SYBR®Premix EX TaqⅡ(宝生物工程有限公司，批号：RR420L)，Dy-Light 800 红外二抗(KPL实验技术公司，批号：AA0454)，放射免疫沉淀分析(radio immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液(北京普利莱生物技术公司，批号：C1053)，双喹啉-4-羧酸二钠盐(bicin choninic acid,BCA)蛋白定量分析盒(北京普利莱生物技术公司，批号：P1511)，小鼠抗人IGFBP-3多克隆抗体(santa cruz公司，批号：sc-374365)，小鼠抗人甘油醛-3-磷酸脱氨酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)多克隆抗体(santa cruz公司，批号：sc-365062)，siRNA序列(上海英为信生物科技有限公司，批号：RY-42569)，LipofectamineTM 2000转染试剂(美国Invitrogen公司，批号：11668-019)。WD-2102A酶标仪(北京六一仪器厂)。乙二胺四乙酸二钠(Sigma公司，批号：E6758)；胰酶(Sigma公司，批号：P7545)。

1.2 细胞的培养 BGC-823细胞培养采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，培养于37 ℃，5%二氧化碳(CO2)环境。采用含0.02%乙二胺四乙酸二钠(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)的0.25%胰酶消化细胞并传代，选取生长良好的对数期细胞进行实验。

1.3 MTT实验检测Res对BGC-823细胞的抑制作用 选取生长状态良好的对数期细胞制成细胞悬液，并接种于96孔板，细胞密度1.0×105·mL-1，每孔悬液量100 μL。常规培养，待细胞贴壁后分为5组，其中一组为对照组，不做任何处理。其余4组分别暴露于20，40，80，160 μmol·L-1Res中。每组设5个平行孔，同时设调零孔。常规培养24 h后，每孔加入MTT试剂10 μL，继续培养4 h。弃去各孔中原有液体，加入二甲基亚砜(dimethyl-sulforide,DMSO)100 μL，置于摇床15 min，使其充分溶解。使用WD-2102A酶标仪测定各孔在490 nm处的吸光度(A值)。计算细胞存活率：细胞存活率(%)=实验组A值/对照组A值×100%。实验重复3次。

1.4 实时荧光定量PCR 检测Res处理后BGC-823的IGFBP-3 mRNA表达水平 收集对数期细胞，制备细胞悬液，以1.0×105·mL-1密度接种于6孔板，每孔2.0 mL。细胞贴壁后分为5组：对照组和20，40，80，160 μmol·L-1Res处理组。继续培养24 h。使用RNA iso裂解试剂提取细胞总RNA。使用PrimeScript RT 试剂盒对提取出的RNA进行反转录，获取cDNA模板。反转录体系参照试剂盒说明书。使用SYBR Premix Ex Taq II试剂盒对上述合成的cDNA进行PCR扩增，引物序列见表1。反应体系和方案参照试剂盒说明书。选择GAPDH作为内参。使用PCR仪自带软件查看并分析反应结果，使用2-△△Ct法处理数据，获取各组IGFBP-3的mRNA相对表达情况。

表1 IGFBP-3与内参β-actin引物序列

Tab.1 Primer sequence of IGFBP-3 and β-actin

引物引物序列(5′⁃3′)IGFBP⁃3ForwardprimerCAGCCAGCGCGCTACAAGTTGACTAIGFBP⁃3ReverseprimerCTGGGACTCAGCACATTGAGGAGAPDHForwardprimerTGGCACCCAGCACAATGAAGAPDHReverseprimerCTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA

1.5 Western blot检测Res处理后BGC-823的IGFBP-3 蛋白表达水平 收集对数期细胞，并制备细胞悬液，以1.0×105·mL-1密度接种于6孔板，每孔2.0 mL。细胞贴壁后，将其分为5组：对照组，20，40，80，160 μmol·L-1Res处理组。继续培养24 h。使用含有1%蛋白酶抑制剂混合物的RIPA蛋白裂解液(每孔500 μL)裂解细胞提取总蛋白。将总蛋白样本与上样缓冲液混匀，煮沸3 min后上样，每孔上样量20 μg。使用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压100 V，时间1.5 h。随后转膜，使用醋酸纤维素(nitrocellulose,NC膜)，转膜条件为恒流200 mA，时间1.0 h。转膜完成后，使用5%脱脂奶粉室温封闭1 h。分别使用小鼠抗人IGFBP-3抗体(1：500)与小鼠抗人GAPDH抗体(1：1 000)4 ℃孵育过夜。磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffed solution,PBS)洗涤3次，除去未结合的一抗。Dy-Light 800红外标记的二抗避光孵育膜2 h，PBS洗涤3次，除去多余二抗，远红外成像系统分析蛋白条带。

1.6 使用siRNA进行IGFBP-3的表达沉默及其对Res抑制效能的影响 以每孔1×104个的密度将细胞接种于无抗生素的培养基中，96孔板中常规培养24 h。使用无血清RPMI-1640培养液分别稀释siRNA(终浓度100 nmol·L-1)与LipofectamineTM 2000转染试剂(1：50)，并将稀释后的siRNA与稀释后的转染试剂混合(总体积100 μL)，将此混合液充分振荡后室温静置20 min，每孔加入上述混合液100 μL。同时按此法设立无关序列的siRNA阴性对照组。加入含10%血清的PRMI-1640培养液100 μL，混合均匀继续培养48 h，炎症IGFBP-3在mRNA水平与蛋白水平的沉默效果。获取良好沉默效果的细胞，照“1.3”项下方法进行MTT实验，分为不做任何处理的对照组、160 μmol·L-1Res处理的普通BGC-823细胞组(Res组)、160 μmol·L-1Res处理的IGFBP-3沉默的BGC-823细胞组(siRNA+Res组)。

1.7 流式细胞仪检测细胞凋亡 分组同“1.6”项MTT分析，即将细胞分为对照组、Res组、siRNA组、siRNA +Res组，培养24 h后，收集细胞，使用预冷冰PBS洗涤细胞，离心后使用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒中的缓冲液500 μL 重悬浮细胞。依次加入Annexin V 5 μL及PI 10 μL，常温避光静置10 min后，使用流式细胞仪分析获取散点图，计数右上象限和右下象限的百分比之和作为总凋亡率，实验重复3次。

1.8 统计学方法 使用SPSS18.0版统计软件进行统计学分析。多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Res抑制BGC-823细胞增殖 见图1。MTT分析显示，Res可以抑制BGC-823细胞增殖，且抑制程度呈浓度依赖关系。40，80，160 μmol·L-1Res处理组细胞存活率分别为(74.30±12.36)%，(62.80±14.66)%，(50.75±11.14)%，与对照组[82.35±10.65)%]比较，均差异有统计学意义(均P<0.05)。

2.2 Res导致BGC-823细胞IGFBP-3表达水平增高 与对照组比较，20，40，80，160 μmol·L-1Res处理组细胞IGFBP-3 mRNA水平分别提高(1.35±0.03)，(1.86±0.05)，(2.11±0.07)，(2.96±0.08)倍，均差异有统计学意义(均P<0.05)。20，40，80，160 μmol·L-1Res处理组BGC-823细胞IGFBP-3蛋白水平升高，条带灰度值与对照组比较，均差异有统计学意义(P<0.05)，见图2，3。

2.3 IGFBP-3沉默缓解了Res对BGC-823细胞的增殖抑制 siRNA技术沉默IGFBP-3表达后，以160 μmol·L-1Res刺激BGC-823细胞，细胞存活率下降为(78.51±9.86)%，高于160 μmol·L-1Res刺激的未经IGFBP-3沉默的BGC-823细胞[(58.32±13.63)%]，两组比较，差异有统计学意义(t=2.861，P<0.05)。siRNA处理不影响细胞生存率[(92.54±14.33)%]。见图4。

2.4 IGFBP-3沉默对Res诱导的细胞凋亡的影响 AnnexinV-FITC/PI双染结合流式细胞技术分析发现，Res可诱导BGC-823细胞凋亡。对照组细胞凋亡率(7.44±2.01)%，Res处理后，细胞凋亡率(35.48±11.12)%，siRNA处理组细胞凋亡率(20.13±9.12)%，siRNA处理组与Res处理组比较，差异有统计学意义(t=2.913，P<0.05)。表明IGFBP-3沉默可以减轻Res所致BGC-823细胞凋亡。见图5。

A.对照组；B.20 μmol·L-1Res组；C.40 μmol·L-1Res组；D.80 μmol·L-1Res组；E.160 μmol·L-1Res组；与对照组比较，*1P<0.05

图1 5组细胞存活率测定结果

A.control； B.20 μmol·L-1Res group；C.40 μmol·L-1Res group；D.80 μmol·L-1Res group；E.160 μmol·L-1Res group；Compared with control，*1P<0.05

Fig.1 Survival rate of five groups of cells

A.对照组；B.20 μmol·L-1Res组；C.40 μmol·L-1Res组；D.80 μmol·L-1Res组；E.160 μmol·L-1Res组；与对照组比较，*1P<0.05

图2 5组细胞IGFBP-3 mRNA水平测定结果

A.control group；B.20 μmol·L-1Res group；C.40 μmol·L-1Res group；D.80 μmol·L-1Res group；E.160 μmol·L-1Res group；Compared with control，*1P<0.05

Fig.2 Relative expression of IGFBP-3 mRNA in five groups of cells

A.对照组；B.20 μmol·L-1Res组；C.40 μmol·L-1Res组；D.80 μmol·L-1Res组；E.160 μmol·L-1Res组

图3 5组细胞IGFBP-3 蛋白表达变化

A.control group；B.20 μmol·L-1Res group；C.40 μmol·L-1Res group；D.80 μmol·L-1Res group；E.160 μmol·L-1Res group

Fig.3 Expression of IGFBP-3 protein in five groups of cells

3 讨论

Res广泛存在于植物中，毒性较低，有良好的应用前景。大量研究认为，Res抑制肿瘤细胞增殖的机制是诱导细胞凋亡，该过程中存在Caspase-3激活。Caspase处于细胞凋亡信号转导通路的核心位置，激活Caspase-3通过级联反应干扰细胞信号转导，DNA修复等功能从而诱发凋亡[9-10]。Res还可通过Fas/FasL途径诱导细胞凋亡，机制还涉及其他多个凋亡调控因子[11]。但目前研究结果还不足以完全解释Res发挥凋亡作用的机制，如Res是如何激活上述因子的机制还未得到证实。笔者在研究中假设IGFBP-3扮演了Res激活凋亡因子的中间角色，即Res首先提高IGFBP-3的表达水平，通过IGFBP-3再与其他凋亡因子发生作用。本研究发现Res处理细胞后，IGFBP-3的表达增高，这在一定程度上与之前假设一致。IGFBP-3是胰岛素样生长因子结合蛋白家族的重要成员，可从以下两个途径引起细胞增殖抑制：首先 IGFBP-3可以与IGF-1特异性结合，从而减少游离的有活性的IGF-1水平，细胞由于缺少IGF-1活性，生长受限[12]。其次，IGFBP-3可以通过其他一些凋亡调控因子发挥凋亡作用。例如，IGFBP-3可以影响MAPK通路，MAPKs 家族的成员主要有JNK、ERK、以及P38。这些成员发生磷酸化激活后，可进一步激活相关转录因子，对凋亡产生促进作用[13]。除此之外，IGFBP-3可以加强TGF-β1诱导的p38的活化，从而增加细胞凋亡，Bcl-2家族、Bad、Bax、NF-κB等凋亡调控因子与IGFBP-3的关系也有报道。既往研究表明，Res促进凋亡的过程除了与Caspase家族有关外，也与MAPKs通路、Bcl-2家族、Bad、Bax、NF-κB等因子相关[14]。因此，不难假设Res的抗凋亡作用与IGFBP-3有一定的联系。本研究发现，在Res诱导胃癌细胞凋亡的过程中，细胞内的IGFBP-3表达有所增多，提示Res可能通过IGFBP-3参与了对凋亡的促进。通过siRNA技术沉默IGFBP-3后，Res的增殖抑制作用不明显，这进一步证实了IGFBP-3在此过程中的作用。但Res如何提高IGFBP-3表达，IGFBP-3提高后导致哪些下游哪些通路的活化或抑制，目前还无法解释，需在后续研究中探索。总之，本研究发现Res能够抑制胃癌BGC823细胞的增殖，并且该过程伴有IGFBP-3表达增多，IGFBP-3可能在Res抑制肿瘤细胞增殖的过程中发挥一定作用。

A.对照组；B.160 μmol·L-1Res处理的普通BGC-823细胞组(Res组)；C.未经res处理的IGFBP-3沉默BGC-823细胞组(siRNA)；D.160 μmol·L-1Res处理的IGFBP-3沉默BGC-823细胞组(Res+siRNA组)；与对照组比较，*1P<0.05；与20 μmol·L-1Res组比较，*2P<0.05

图4 IGFBP-3基因沉默后4组细胞存活率

A.control；B.160 μmol·L-1Res treated non-transfected BGC-823 cells(Res group)；C.IGFBP-3 silence BGC-823 cells(siRNA)；D.160 μmol·L-1Res treated IGFBP-3 silence BGC-823 cells(Res+siRNA)；Compared with control，*1P<0.05；compared with Res group 20 μmol·L-1，*2P<0.05

Fig.4 Survival rate of five groups of cells after IGFBP-3 knockdown

A.对照组；B.160 μmol·L-1Res处理的普通BGC-823细胞组(Res组)；C.160 μmol·L-1Res处理的IGFBP-3沉默BGC-823细胞组(Res+siRNA组)；D.未经res处理的IGFBP-3沉默BGC-823细胞组(siRNA)；与对照组比较，*1P<0.05；与20 μmol·L-1Res组比较，*2P<0.05

图5 IGFBP-3基因沉默后4组细胞凋亡率

A.control；B.160 μmol·L-1Res treated non-transfected BGC-823 cells(Res group)；C.160 μmol·L-1Res treated IGFBP-3 silence BGC-823 cells(Res+siRNA)； D.IGFBP-3 silence BGC-823 cells(siRNA)；Compared with control，*1P<0.05；compared with Res group 20 μmol·L-1，*2P<0.05

Fig.5 Apoptosis rate of four groups of cells after IGFBP-3 knockdown

[1] 王晓雷.胃癌的治疗进展[J].医学理论与实践，2012，25(22): 2758-2761.

[2] 刘坤，李国立.胃癌的靶向治疗[J].中国实用外科杂志， 2010，30(7): 545-547.

[3] SANTOS J A，DECARVAHO G S G，OLIVEIRA V，et al.Resveratrol and analogues: a review of antioxidant activity and applications to human health[J].Recent Pat Food Nutr Agric，2013，5(2): 144-153.

[4] 刘芝兰， 曾春娇，吴梅青，等.白藜芦醇与白皮杉醇及赤松素研究进展[J].医药导报，2013，32(8): 1043-1049.

[5] 金洲祥，李永国，朱少俊，等.白藜芦醇对胰腺癌细胞的抑制作用[J].肝胆胰外科杂志， 2007，19(6): 352-354.

[6] 周海波，颜云，蔡建庭，等.白藜芦醇诱导胃癌原代细胞凋亡(英文)[J].中国病理生理杂志， 2005,21(7): 1340-1344.

[7] ZHANG C，GE S，HU C，et al.MiRNA-218， a new regulator of HMGB1， suppresses cell migration and invasion in non-small cell lung cancer[J].Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai)， 2013， 45(12): 1055-1061.

[8] YOSHINO K， MOTOYAMA S， KOYOTA S， et al.IGFBP3 and BAG1 enhance radiation-induced apoptosis in squamous esophageal cancer cells[J].Biochem Bioph Res Co， 2011， 404(4): 1070-1075.

[9] SHIMIZU T， NAKAZATO T， XIAN M J， et al.Resveratrol induces apoptosis of human malignant B cells by activation of caspase-3 and p38 MAP kinase pathways[J].Biochem Pharmac， 2006， 71(6): 742-750.

[10] 林鸿，文军，陈祥荣，等 双氢青蒿素对恶性胶质母细胞瘤细胞增殖与凋亡的影响[J].医药导报， 2013，32(8): 1003-1007.

[11] 郑国华，李会庆.大蒜油和白藜芦醇联合应用诱导胃癌细胞凋亡对Fas、bcl-2和bax基因表达的影响[J].中华预防医学杂志，2008， 42(1): 39-42.

[12] 孔海波，扈玉华，徐东刚.IGFBP-3的功能及其对凋亡相关信号通路的作用[J].医学研究杂志， 2011,40(7): 17-22.

[13] O'HAN M K，BAXTER R C，SCHEDLICH L J.Effects of endogenous insulin-like growth factor binding protein-3 on cell cycle regulation in breast cancer cells[J].Growth Factors， 2009， 27(6): 394-408.

[14] BUTT A J，FIRTH S M，KING M A，et al.Insulin-like growth factor-binding protein-3 modulates expression of Bax and Bcl-2 and potentiates p53-independent radiation-induced apoptosis in human breast cancer cells[J].J Bio Chem，2000，275(50): 39174-39181.

DOI 10.3870/yydb.2015.03.009

Effect of IGFBP-3 in the Inhibition of Gastric Carcinoma Cells Proliferation by Resveratrol

SUN Haibin， HE Xiaoyan，MA Mei

(DepartmentofPathology，theFifthAffiliatedHospitaltoZhengzhouUniversity，Zhengzhou450000，China)

Objective To study the expression of insulin like growth factor binding proteins 3 (IGFBP-3) during inhibition of resveratrol (Res) on cell proliferation. Methods The inhibitory effect of Res on BGC-823 cells was determined by MTT method; Real-time qRT-PCR and western blot were applied to detect the expression of IGFBP-3 in Res-treated BGC-823 cells.In addition, cytometry was used to determine the proliferation and apoptosis of Res-treated BGC-823 after knockdown of IGFBP-3 by siRNA. Results Upon Res (20，40， 80 and 160 μmol·L-1) treatment，the viability of BGC-823 cells was (82.35±10.65)%，(74.30±12.36)%，(62.80±14.66)% and (50.75±11.14)%， respectively.The mRNA and protein expression of IGFBP-3 elevated as high as 2.96-fold compared to the control group (P<0.05).The cell viability of BGC-823 cells with IGFBP-3 knockdown was significantly higher than that of the wild type (P<0.05) only at high Res concentration (160 μmol·L-1).Meanwhile，IGFBP-3 knockdown led to a significant decrease on cell apoptotic rate by Res (160 μmol·L-1) [(20.13±9.12)% vs (35.48±11.12)%，P<0.05)]. Conclusion Res can inhibit BGC-823 cell proliferation and promote cell apoptosis, the underlying mechanism of which may be related to the overexpression of IGFBP-3 in BGC-823 cells.

Resveratrol; insulin like growth factor binding proteins 3 (IGFBP-3); BGC-823 cell

2014-01-08

2014-02-10

孙海斌(1963-)，男，河南郑州人，副主任医师，学士，主要研究方向：肿瘤病理。E-mail：sunhb5h@163.com。

何晓燕(1985-)，女，河南郑州人，主治医师，硕士，主要研究方向：肿瘤病理。E-mail：he_xiaoyan2010@163.com。

R286；R965

A

1004-0781(2015)03-0317-05