固相萃取-高效液相色谱法同时测定血浆中氯米帕明和4种苯二氮类药物浓度方法的研究

郑付春, 石刚刚

(汕头大学医学院 1.第一附属医院药剂科、2. 药理学教研室，广东 汕头 515041)

◇实验方法学◇

郑付春1, 石刚刚2

(汕头大学医学院 1.第一附属医院药剂科、2. 药理学教研室，广东 汕头 515041)

目的 建立同时测定血浆中氯米帕明和4种苯二氮类药物奥沙西泮、地西泮、氯硝西泮、阿普唑仑浓度的固相萃取-高效液相色谱法(HPLC)。方法 XTerra C8 RP(4.6 mm×150 mm，5 μm)为色谱柱，磷酸盐缓冲液(50 mmol·L-1，pH 3.0)和乙腈(73.2:26.8，V/V)为流动相，流速1.2 mL·min-1，柱温45 ℃；检测波长 220 nm，血浆经C1固相萃取柱预处理。结果 线性范围分别为：阿普唑仑、氯硝西泮5.0～200.0 μg·L-1，地西泮10.0～500.0 μg·L-1，氯米帕明20.0～500.0 μg·L-1，奥沙西泮7.5～2 000 μg·L-1，相关系数均大于0.999 4；最低检测限分别为：阿普唑仑1.5 μg·L-1、氯硝西泮1.4 μg·L-1、地西泮3.0 μg·L-1、氯米帕明5.5 μg·L-1、奥沙西泮2.2 μg·L-1；日内及日间精密度(CV%)分别为2.2%～12.6%、2.1%～13.2%，偏差-10.6%～14.6%，提取回收率81.1%～100.1%。结论 该法可用于临床血浆中氯米帕明和4种苯二氮类药物的同时检测，方法新颖、灵敏、经济，结果准确、可靠。

固相萃取法；氯米帕明；地西泮；奥沙西泮；氯硝西泮；阿普唑仑；高效液相色谱法

氯米帕明是临床治疗重度抑郁常用的三环类药物之一，并用于强迫症、焦虑症治疗。其机制主要是抑制五羟色胺再摄取，同时也是组胺H1受体、乙酰胆碱毒蕈碱受体和肾上腺素α1受体的拮抗剂/反向激动剂，后三者效应与其不良反应直接有关[1]。众所周知，氯米帕明在临床有好的治疗效果，但明显的副作用也影响它应用的安全性，如：增加癫痫发作、心脏毒性、认知损害、抗胆碱能不良反应、药物相互作用以及过量致死性等[2]，在临床需个体化治疗，监测患者血药浓度是个体化用药的重要保证。

1 材料与仪器

1.1 药品试剂甲醇(北京百灵威科技有限公司)和乙腈(瑞典Oceanpak公司)为色谱纯，其它试剂为分析纯；去离子水为Milli-Q50超纯水；地西泮、奥沙西泮、氯硝西泮、阿普唑仑，氯米帕明和盐酸苯海拉明(内标)对照品(中国药品生物制品检定所)，空白血浆(汕头大学医学院第一附属医院血库)。

1.2 仪器设备Agilent 1100高效液相色谱系统(包括四元泵、真空脱气泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器DAD、数据分析软件Chem Station for LC 3D Rev.A.10.01[1635]，美国Agileng公司)；AL204电子天平(瑞士Mettle Toledo公司)；PHS-3CA精密酸度计(上海大浦仪器有限公司)；Anke TGL-16G高速低温冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；MS3涡旋仪(德国IKA 公司)；Milli-Q50超纯水仪(美国Millipore公司)。

2 方法

2.1 标准溶液配制分别精密称量地西泮、奥沙西泮、氯硝西泮、阿普唑仑、氯米帕明和内标对照品10 mg，用甲醇定容至10 mL，配制浓度为1 g·L-1的标准品储备液，-20 ℃保存。浓度0.05 g·L-1的工作液当天用流动相新鲜配制。所有溶液避光保存。

2.2 标准曲线和质控样品配制精密量取对照品地西泮、奥沙西泮、氯硝西泮、阿普唑仑和氯米帕明工作液(0.05 g·L-1)，加入空白血浆，配制如下终浓度的标准曲线样品：氯硝西泮和阿普唑仑：5.0～200.0 μg·L-1(5、12.5、25、50、100、200 μg·L-1)；地西泮：10.0～500.0 μg·L-1(10.0、31.25、62.5、125、250、500 μg·L-1)；氯米帕明：20.0～500.0 μg·L-1(20.0、31.25、62.5、125、250、500 μg·L-1)；奥沙西泮：7.5～2000 μg·L-1(7.5、50、125、250、500、1000、2000 μg·L-1)。并配制各低中高浓度质控样品(QC)。

2.3 血浆样品预处理取固相萃取柱Bond Elut-C1(100 mg, 1 mL) (美国Agilent公司)，依次用5 mL甲醇、超纯水活化；取500 μL 血浆，加入1 000 μL磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，加入内标工作液50 μL，涡旋1 min混匀后上样至上述C1柱；分别用1 mL去离子水、1 mL水/甲醇混合液(80 ∶20，V/V)淋洗1次弃去；用2 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，45 ℃氮气吹干，复溶于125 μL流动相，离心后取上清液进样。

2.4 色谱条件色谱柱Waters XTerra C8 RP(4.6 mm×150 mm，5 μm)，保护柱Agilent Zobax-Extend C18 (4.6 mm×10 mm，5 μm)；流动相50 mmol·L-1磷酸盐缓冲液(pH3.0):乙腈(73.2:26.8，V/V)；检测波长 220 nm，柱温45 ℃，流速1.2 mL·min-1，进样量50 μL。

2.5 临床应用患者服用恒定日剂量药物2周后，于末次服药后12 h取血约1.2 ml，置于枸橼酸钠抗凝管，2 h内离心(1 400 r·min-1，15 min)，取血浆存于-20 ℃待测。

3 结果

3.1 方法选择性取6份不同来源空白血浆500 μL，除不加内标外，其余按“2.3 血浆样品预处理”项下操作，获空白血浆色谱图A；将标准溶液和内标溶液加入空白血浆，依同法操作，获含药血浆色谱图B；由Fig 1 可以看出，成分间分离良好，未见血浆中杂质干扰。

3.2 线性范围及最低检测限(LOD)将标准曲线样品按“2.3 血浆样品预处理”项下操作。以被测药物峰面积与内标峰面积之比为纵坐标Y，被测药物浓度为横坐标X，用最小二乘法进行线性回归，计算回归方程。LOD定义为信噪比≥3。从Tab 1可以看出，各药物在其线性范围内均呈现良好线性关系，相关系数均在0.9994及以上，LOD在1.4～5.5 μg·L-1之间。

Tab 1 Calibration, limit of detection (LOD) and limit ofquantitation (LOQ) for clomipramine and four BZDs

Y represents the peak area ratio of each drug to the IS, X represents the concentration of compound (μg·L-1)

Fig 1 Chromatograms obtained from (A) blank human plasma, (B) spiked human plasma with compounds

(all in 100 μg·L-1). Peaks: 1: Oxazepam, 2: Alprazolam, 3: Clonazepam, 4: Clomipramine, 5: IS, 6: Diazepam.

3.3 精密度和准确度将“2.2”项下配制的QC样品，每个浓度进行5 样本分析，连续测定5 d，与标准曲线同时进行。根据当日标准曲线计算QC浓度，与配制浓度对比，求得本方法的精密度与准确度。结果表明(Tab 2)，被测化合物的日内误差(CV%) 为2.2%～12.6%，日间误差(CV%) 为2.1%～13.2%，偏差为-10.6%～14.6%。

3.4 提取回收率取低中高浓度质控样品，重复测定5次，记录峰面积，与未经处理相应浓度药物标准溶液直接进样峰面积比较，计算提取回收率。被测药物及内标的提取回收率为81.1%～100.9%，见Tab 2。

3.5 稳定性标准品贮备液-20 ℃冻存2个月稳定，含药血浆-20 ℃冻存2个月稳定，含药血浆冻融3次稳定，样品处理后4 ℃放置0、12、24 h稳定，未处理样品室温放置0、2、4 h稳定。

3.6 临床应用目前已对临床服用奥沙西泮、氯米帕明的患者进行了血药浓度检测，色谱图见Fig 2。

4 讨论

本工作建立了在临床单用HPLC同时测定血浆中氯米帕明和4 种苯二氮类药物浓度的方法，这对于科研实验中采用液质联用或气质联用测定相比花费低、且操作简便，并可做到同时迅速、准确地一次性分别进行定性定量分析，可满足临床对血浆样品中此类药物含量测定要求。该方法在临床尤其实用，可在国内推广使用。

Tab 2 Precision, accuracy and extraction yield results

a:Bias (%)=100×[(mean measured concentration)-(theoretical concentration)]/(theoretical concentration). b: Intra-day (n=5). c: Inter-day (n=5×5). d: Extraction yield (%)=analyte peak area compared to those obtained by injecting standard solutions at the same theoretical concentrations and the extraction yield values were calculated.

Fig 2 Chromatograms obtained from plasma samples in patients treated with (A) oxazepam; (B) clomipramine 1:Oxazepam;4:Clomipramine;5:IS

实验中观察了2种色谱柱：ODS2(4.6 mm×250 mm，5 μm) 和 C8 (4.6 mm×150 mm，5 μm)。结果显示，前者C18柱不能完全分离5种被测物，且分析时间长，可能源于药物极性较小，在C18柱上保留时间长；而C8柱则能较好分离各组分，并缩短分析时间。流动相pH 值对色谱行为影响非常明显。在流动相摸索中，首先采用流动相水相pH 2.5、pH 4.3，发现峰展宽、拖尾、且分离不完全。我们又考察了不同的pH值，结果显示，pH 3.0效果最好，改善分离度及峰形，且具适当保留时间。

本工作的难点是样品的前处理，在血浆中，同时、高效提取氯米帕明和苯二氮这两类药物并去除干扰是非常困难，但又是必须的。文献报道[12]采用弱阳离子交换(WCX) 固相萃取柱进行血浆预处理，但洗脱时需分酸性和碱性洗脱层分别收集被测物，再分别进样，方法耗时、复杂，不适于临床应用。孙红雷等[9]结果显示C18柱提取苯二氮等安眠药效果最差，C2柱提取效果不均匀，而且去除杂质效果较差。乔静等[15]测试了几种固相萃取柱对氯硝西泮的提取效率，结果显示Silica柱、C18柱及HLB柱的回收率均较低，为36%～73.5%。Shinozuka等[11]结果显示，HLB柱对氯米帕明提取回收率仅为72.4%。我们根据以上报道，改进了萃取方法，采用了极性较大的C1柱，提高了极性及非极性化合物，即苯二氮类及其活性代谢产物的回收率。改进的方法国内未见报道。

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Simultaneous determination of clomipramine and four benzodiazepines in human plasma by HPLC-DAD after solid phase extraction

ZHENG Fu-chun1, SHI Gang-gang2

(1.DeptofPharmacy，the1stAffiliatedHospital; 2.DeptofPharmacology，ShantouUniversityMedicalCollege，ShantouGuangdong515041，China)

Aim To establish a novel, highly sensitive, rapid and cost-effective HPLC method to simultaneously determine tricyclic antidepressant clomipramine and four benzodiazepines of diazepam, alprazolam, clonazepam, oxazepam in human plasma pretreated by solid phase extraction. Methods The assay was achieved by using C8 column (4.6 mm×150 mm, 5 μm) kept at 45 ℃, mobile phase 73.2:26.8V/V(50 mmol·L-1, pH 3.0 phosphate buffer: acetonitrile) with flow rate of 1.2 ml·min-1, and UV detection was set at λ220 nm. Solid phase extraction was performed on C1 cartridges. Results The calibration curve was demonstrated to be linear (r>0.9994) in the ranges of 5～200 μg·L-1for alprazolam and clonazepam, 10～500 μg·L-1for diazepam, 20～500 μg·L-1for clomipramine, and 7.5～2000 μg·L-1for oxazepam; the limit of detection (LOD) was 1.5,1.4, 3.0, 5.5 and 2.2 μg·L-1for alprazolam, clonazepam, diazepam, clomipramine and oxazepam respectively. Intra-day and inter-day precision revealed a coefficient of variation of 2.2%～12.6% and 2.1%～13.2%, respectively. Extraction yield ranged from 81.1%～100.1% for all analytes. Conclusion The developed method is accurate, reproducible, convenient, and suitable for routine therapeutic drug monitoring of clomipramine and the four benzodiazepines.

solid phase extraction; clomipramine; diazepam; oxazepam; clonazepam; alprazolam; HPLC

时间：2015-3-16 15:41 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150316.1541.028.html

2014-10-17,

2015-02-15

中央财政支持地方高校发展专项资金；广东省自然科学基金团队项目(No 9351503102000001)；广东省自筹经费类科技计划项目

郑付春(1967-)，女，硕士，副主任药师，研究方向：新药开发研究，E-mail: zhengfc@stu.edu.cn,Tel:0754-88905491； 石刚刚(1957-)，男，博士，教授，博士生导师，研究方向：心血管药理学及药物开发，通讯作者， Tel：0754-88566782， E-mail:ggshi@stu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.04.028

A

1001-1978(2015)04-0582-04

R446.11；R971.3；R971.4