RNA干扰抑制Beclin1基因对裸鼹鼠成纤维细胞增殖与凋亡的影响

赵善民，肖邦，林丽芳，宫晨，王运慧，程继帅，余琛琳，丛薇，汤球，孙伟，崔淑芳

（第二军医大学实验动物中心，上海 200433)

研究报告

RNA干扰抑制Beclin1基因对裸鼹鼠成纤维细胞增殖与凋亡的影响

赵善民，肖邦，林丽芳，宫晨，王运慧，程继帅，余琛琳，丛薇，汤球，孙伟，崔淑芳*

（第二军医大学实验动物中心，上海 200433)

目的应用RNA干扰技术抑制自噬调控基因Beclin 1的表达，检测Beclin 1表达对裸鼹鼠皮肤成纤维细胞增殖与凋亡的影响以及p53、BAX、Bcl2等基因表达的影响。方法分别检测裸鼹鼠成纤维细胞经饥饿、H2O2刺激等处理后Beclin 1的表达，然后采用设计的Beclin l基因的干扰RNA及阴性对照分别瞬时转染裸鼹鼠成纤维细胞。采用real-time PCR及Western blot法检测沉默效果后，采用CCK-1实验检测沉默后细胞增殖活性，流式细胞仪检测细胞凋亡情况，然后采用Western blot检测相关基因蛋白表达水平。结果饥饿与H2O2刺激均能导致Beclin 1表达水平的改变。采用gene expresso转染试剂对裸鼹鼠皮肤成纤维细胞转染效率可达到90%以上，real-time PCR及Western blot结果显示所设计的Beclin 1 siRNA可有效降低Beclin 1的表达。Beclin 1基因沉默后，裸鼹鼠皮肤成纤维细胞增殖抑制率均显著高于对照组，细胞早期凋亡与晚期凋亡率均显著升高，同时p53、BAX、Bcl2、LC3B、p-AKT、mTOR等表达量下降。结论Beclin 1在裸鼹鼠成纤维细胞抵抗饥饿、H2O2刺激等过程中表达量显著变化，同时抑制Beclin 1的表达，可抑制裸鼹鼠细胞增殖，促进其凋亡，这提示Beclin 1基因对裸鼹鼠自噬、增殖、凋亡起到调控作用。

裸鼹鼠；成纤维细胞；Beclin 1；RNA干扰；增殖；凋亡

裸鼹鼠是一种具备抗肿瘤、抗衰老、耐低氧等优势生物学特征的新型实验动物资源，目前已被科学家应用于肿瘤学、免疫学及心血管学等领域的研究[1-3］。研究表明裸鼹鼠在抗肿瘤方面具有多种特殊的分子信号机制抵抗细胞的过量增殖及肿瘤的产生，例如裸鼹鼠独特的早期接触抑制机制，其成纤维细胞分泌高分子质量的透明质酸（HMM-HA)等[4，5］。Beclin 1是调控自噬的重要基因，研究显示乳腺癌、脑肿瘤、宫颈癌、卵巢癌中出现Beclin 1蛋白表达的下降[6，7］。多种肿瘤已经证实存在Beclin 1等自噬基因的缺陷，能够逃避自噬性死亡。因此，多数学者认为Beclin 1是一种抑癌基因。同时Beclin 1作为参与自噬发生的特异性基因，是自噬发生的重要调控分子，在自噬形成过程中起重要作用。自噬的发生过程需要多种分子的参与，其调控机制非常复杂。前期我们发现，新生裸鼹鼠肝脏、肺脏等组织中自噬水平显著高于C57BL/6小鼠[8，9］。本实验进一步研究了自噬相关基因Beclin1表达下调之后对裸鼹鼠细胞增殖与凋亡的影响，为深入探讨Beclin 1在裸鼹鼠自噬、凋亡中的作用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

裸鼹鼠原代皮肤成纤维细胞按照本实验室前期方法分离培养[10］；主要试剂有细胞裂解液 RIPA、PMSF、预染蛋白marker均购自上海碧云天生物技术有限公司；AKT（Phospho-Ser473)抗体、mTOR抗体、BAX抗体购自美国Signalway Antibody公司；βactin、p53抗体、Bcl2抗体购自美国Proteintech公司；Beclin 1抗体购自英国Abcam公司；LC3 B抗体购自美国Cell Signaling公司；Annexin V-PI双染色法试剂购自美国BD公司；gene expresso转染试剂购自南京迈极生物公司；CCK8检测试剂盒购自美国Signalway Antibody公司；DMEM培养基购自美国Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞准备

细胞接种于直径60 mm的培养皿中，接种密度1×106/皿，在37℃三气培养箱中培养。细胞培养采用三气培养箱控制条件为3%O2、5%CO2及 92%N2。隔天换液一次，3 d传代。裸鼹鼠成纤维细胞的刺激分为3组:饥饿处理组、H2O2处理组、正常组。饥饿处理是指用无血清的培养基进行培养。H2O2处理采用900μmol/L H2O2进行共孵育。正常组为3%O2、5%CO2。用于Beclin 1 siRNA转染的细胞于转染前一天进行铺板，细胞用不含抗生素的正常生长的培养基进行培养。用于细胞RNA、蛋白提取及凋亡率检测的细胞置于6孔板中培养，用于CCK8检测的细胞置于96孔板中培养。

1.2.2 siRNA转染

当6孔板中的细胞达到90%时进行转染，转染按照Gene Expresso转染试剂说明书进行，具体为，取240μL Opti-MEM培养液于EP管中，加入10μL siRNA，另取240μL Opti-MEM培养液加入10μL gene expresso，放置5 min后轻轻混匀，再室温放置20 min，然后向其中加入1.5 mL培养液混匀后置换培养细胞中的培养液，同时转染Cy3标记的siRNA，观察转染效率。培养48 h后，用荧光显微镜观察并拍照。Beclin 1 siRNA序列为:5’-CUCAAGUUCAUGCUGACCAdTdT-3’和 5’-UGGUCAGCAUGAACUUGAGdTdT-3’[11］，引物序列由百奥生物技术（南通)有限公司合成。

1.2.3 RNA的提取

Beclin 1 siRNA转染24 h后，采用TRIzol试剂盒抽取裸鼹鼠皮肤成纤维细胞总RNA，并用紫外分光光度计检测260/280比值，初步确定总RNA的浓度及纯度。然后用DNase I去除总RNA中的基因组DNA。将RNA按照Takara逆转录试剂盒操作程序反转录成cDNA。

1.2.4 Real-time PCR检测相关基因的表达

对各组织总RNA进行反转录合成cDNA，将cDNA进行2倍稀释作为检测模板，按照设定的反应体系和反应程序，检测各组织中Becin 1 mRNA的转录水平。荧光定量PCR仪（美国ABI公司)设置反应程序为:95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，72℃30 s，40个循环，应用比较Ct法进行相对定量。Real-time PCR反应体系为:cDNA模板 1μL，2× SYBR Premix Ex Taq 5μL，上、下游引物（10μmol/ L)0.2μL，ROX Reference Dye（50×)0.2μL，ddH2O 3.4μL，同时设置阴阳性对照，每个样品设3个重复孔。参考Genbank上发表的裸鼹鼠Beclin1、GAPDH基因序列设计引物为:Beclin 1:5’-GTTCAAAGAGGAGGTGGAGAAG-3’和5’-GAGGAA ACCCAGGCAAG AC-3’；GAPDH:5’-CGCCTGCTTCACCACCTT-3’and 5’-CCTGCCGCCTGGAGAAA-3’，引物序列由上海生工合成。

1.2.5 细胞蛋白的提取

Beclin 1 siRNA转染24 h后，取6孔板细胞加0.1 mL预冷的 RIPA裂解液（含有 100 mmol/L FPSM进行匀浆)，冰浴30 min后4℃、12 000 r/min离心30 min，吸取上清蛋白，采用Micro BCA Protein Kit测定细胞蛋白总浓度。

1.2.6 Western Blot检测

取适量总蛋白加2×SDS上样缓冲液，100℃变性5 min。SDS-PAGE分离后转印至硝酸纤维素膜，用1×封闭液室温封闭1 h，一抗用Beclin 1、LC3B、p53、BAX、BCL2、p-AKT、mTOR抗体（1∶2000稀释)，4℃过夜；TBST洗3次，每次5 min，二抗（1∶2000稀释)室温孵育1 h；TBST洗3次，每次5 min，用化学发光（ECL，普利莱公司)显色。以β-actin为内参照，凝胶成像系统扫描成像。

1.2.7 流式检测基因沉默后细胞凋亡率

Beclin 1 siRNA转染24 h后，取6孔板细胞用不含EDTA的胰酶消化收集，用PBS洗涤2次（1000 r/min离心5 min)，收集细胞，加入500μL的binding buffer悬浮细胞，加入10μL annexin V-FITC和10μL PI，混匀后室温避光防止5～15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.8 CCK8检测基因沉默后细胞增殖率

Beclin 1 siRNA转染 6、12、24、48 h后进行CCK8计数，按照说明书进行操作，用酶联免疫检测仪在450 nm波长处测定其吸光度（A)值，以间接反映各组活细胞数量。

1.2.9 数据处理

检测数据用SPSS 12.0软件进行统计，分析不同处理组凋亡率的不同，统计结果用“均数±标准差”表示，并作t检验。

2 结果

2.1 不利刺激对裸鼹鼠皮肤成纤维细胞Beclin1表达的影响

饥饿、H2O2刺激均能导致Beclin 1表达水平的改变。如图1所示，裸鼹鼠成纤维细胞饥饿或者H2O2刺激24 h后，Western blot检测结果均显示Beclin 1表达水平显著下降（图1A和1B)。

图1 不同刺激下裸鼹鼠成纤维细胞Beclin1的表达水平Fig.1 Expression of Beclin1 in different stimulated fibroblasts from the naked mole rat

2.2 Beclin1基因沉默效果的检测

采用Gene Expresso转染试剂对裸鼹鼠皮肤成纤维细胞进行siRNA转染，转染效率可达到90%以上（如图2A和2B)。同时real-time PCR及Western blot结果显示，采用Beclin 1 siRNA可有效降低Beclin 1的表达（如图2C和2D)。

2.3 Beclin1基因沉默对裸鼹鼠皮肤成纤维细胞增殖及凋亡的影响

在转染后的各时间点，裸鼹鼠皮肤成纤维细胞增殖抑制率均显著高于对照组。同时，Beclin 1基因沉默24 h后，细胞早期凋亡与晚期凋亡率均显著升高（见图3、4，P值均＜0.01)。

2.4 Beclin1基因沉默对凋亡相关基因的影响

如图5所示，Beclin 1基因沉默24 h后，LC3B I与II总量及比值发生了变化，PI3K/AKT/mTOR信号通路中p-AKT（Ser473)与mTOR表达量下调，同时与凋亡密切相关的p53、Bcl2、BAX表达量亦下调。

3 讨论

Beclin 1基因与酵母自噬基因Atg6同源，是介导其他自噬蛋白定位于前自噬小体的关键因子，也是参与哺乳动物自噬体形成调控的特异性基因[12］。目前在多种肿瘤中发现了Beclin 1单等位基因的缺失或者Beclin 1蛋白表达下调，提示其与肿瘤的发生、发展和疾病的发生密切相关。但Beclin 1相关抑癌机制目前仍不很清楚，现有研究主要集中在Beclin 1作为一种自噬基因具有诱导自噬、凋亡及抗基因组突变的作用上。前期我们研究发现饥饿、H2O2刺激均能诱导裸鼹鼠成纤维细胞及肝星形细胞自噬水平的升高[11］，本研究结果显示裸鼹鼠细胞饥饿条件下，Beclin 1蛋白表达量显著降低，H2O2刺激亦可导致Beclin 1表达水平的下调，这提示Beclin 1在裸鼹鼠细胞抵抗饥饿及H2O2刺激时起作用。Beclin 1基因沉默可显著抑制裸鼹鼠皮肤成纤维细胞增殖及诱导凋亡产生，与凋亡密切相关的Bcl2、BAX表达量亦下调，并且LC3B总量发生了变化，说明Beclin 1在裸鼹鼠自噬、增殖及凋亡中均发挥作用。McKnight等证实对于人类骨肉瘤HOS细胞，下调Beclin 1基因能够增强顺铂等诱导的细胞凋亡[13-15］。这也提示Beclin 1基因下调可以增强化疗药物对凋亡信号通路的激活，有助于控制肿瘤的增殖。因此，对Beclin 1基因进行更加深入的研究将有助于肿瘤的控制。

图2 Beclin1基因沉默效果Fig.2 The effect of Beclin 1 gene silencing

图3 转染24 h后裸鼹鼠成纤维细胞凋亡率Fig.3 Apoptosis of naked mole rat fibroblasts transfected for 24 h

图4 转染6、12、24、48 h后裸鼹鼠成纤维细胞增殖率（n=5)Fig.4 Proliferation rate of fibroblasts of the naked mole rat at 6，12，24 and 48 h after transfection（n=5)

图5 Beclin1沉默后蛋白表达水平Fig.5 Protein expression of naked mole rat fibroblasts after siRNA inhiibtion of Beclin 1

研究显示p53是平衡肿瘤及衰老的一个重要分界点，保持p53基因的稳态表达是预防肿瘤和早衰的策略之一[16-18］。同时p53作为肿瘤抑制因子，在DNA损伤诱导细胞凋亡中发挥极其重要的作用。Jiang等[19］对头颈部的腺样囊性癌组织分析发现p53与Beclin 1表达量正相关。Liu等[13］研究发现Beclin 1可影响USP10和USP13的去泛素化活性，从而对p53蛋白水平进行调控。因此，裸鼹鼠皮肤成纤维细胞Beclin 1基因下调之后，p53基因表达量的下调，提示Beclin 1可能调控p53的表达。同时Beclin 1基因沉默后细胞凋亡率升高，这表明下调裸鼹鼠细胞Beclin 1基因可以通过p53非依赖信号通路介导凋亡发生。此外，我们发现下调Beclin 1基因后，p-AKT（Ser473)、mTOR表达量降低，提示PI3K/Akt/mTOR信号通路受到抑制。另有学者研究发现Beclin 1的缺失能够干扰PI3K-VPS34复合物的形成[20］。Beclin 1基因下调伴随PI3Kp85α与p-AKT的表达下调，同时细胞增殖率下降，凋亡率升高[21］。这些数据说明Beclin 1基因下调可以通过PI3K/AKT信号通路介导细胞凋亡。

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Inhibitorj effects of Beclin 1 gene expression bj RNA interference on the proliferation and apoptosis in fibroblasts of naked mole rat

ZHAO Shan-min，XIAO Bang，LIN Li-fang，GONG Chen，WANG Yun-hui，CHENG Ji-shuai，YU Chen-lin，CONGWei，TANG Qiu，SUNWei，CUIShu-fang
（Laboratory Animal Center of the Second Military Medical University，Shanghai200433，China)

ObjectiveTo investigate the effects of down-regulation of Beclin 1，which is an autophagy regulatory molecule，expression induced by RNA interference on the proliferation and apoptosis in skin fibroblasts of naked mole rat.M ethodsThe expression levels of Beclin 1 were detected after starvation or H2O2treatment.The fibroblasts were transiently transfected with specific siRNA targeting Beclin 1 and then screened by real-time PCR and Western blot.Cell proliferation and apoptosis were determined using CCK-8 detection kit and flow cytometry（FCM).The expressions of related geneswere detected by Western blot.ResultsThe expression of Beclin 1 gene atmRNA and protein levels was significantly lower in fibroblasts of the nakedmole rat.Starvation and H2O2treatment induced changes of the Beclin 1 expression. Inhibition of Beclin 1 gene expression can inhibit cell proliferation and induce early and late apoptosis.The protein levels of p53，BAX，Bcl2，LC3B，p-AKT and mTOR were reduced after transient transfection with Beclin 1-siRNA.ConclusionsThe expression of Beclin 1 in fibroblasts of nakedmole ratare changed in response to starvation or H2O2stimulation.Inhi-bition of Beclin 1 gene expression can inhibit cell proliferation and induce apoptosis.Therefore，Beclin1 gene may play a regulatory role in autophagy，proliferation and apoptosis in the skin fibroblasts of naked mole rat.

Naked mole rat；Fibroblasts；Beclin 1；siRNA；Proliferation；Apoptosis

Q95-33

A

1005-4847（2015)06-0557-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2015.06.002

2015-11-15

国家科技支撑计划（No.2015BAI09B02)；国家自然科学基金（No.31402028)与上海市卫计委课题（No.20144Y0205)联合资助。

赵善民（1986-)，男，硕士，讲师，研究方向:实验动物标准化及人类疾病动物模型研究。

崔淑芳，教授，研究方向:实验动物标准化及人类疾病动物模型研究。Email:youngstar_sf@163.com，