金钗石斛生物碱对mcf－7细胞线粒体凋亡通路研究

安 欣，任建武*，李虹阳，张秀海，石玉杰

(1.北京林业大学 生物科学与技术学院，北京 100083;2.北京市农林科学研究院 生物技术中心，北京 100097;3.北京大学 医学部药学院，北京 100191)

金钗石斛是我国传统的名贵中药，在提高人体免疫能力［1］、抗衰老［2］、改善肝功能［3］、抑制肿瘤［4］、调血脂［5］等各方面有显著的效果，在民间有“救命仙草”之美称。现代研究表明，金钗石斛含有生物碱、多糖、联苄、芴酮、菲、倍半萜、蛋白质、氨基酸等多种类型的化学成分［6-14］。生物碱是其主要的有效成分，具有抗白内障［15］、降血糖、减轻肝脏脂肪变性、改善记忆减退、改善胃肠道运动等药理作用［16-19］，还具有明显的抗肿瘤活性和免疫调节功能［20］。

细胞凋亡是通过激活特定的蛋白酶——半胱天冬酶(caspase)来介导的。caspase是细胞凋亡的效应器，它可以和许多底物起作用，导致凋亡细胞发生特有的生化和形态学改变，包括线粒体外膜通透性的改变等。在大多数细胞凋亡途径中，线粒体起着起始、放大的中枢调控作用，各种线粒体死亡通路的反馈循环和交叉使线粒体成为凋亡通路的最重要的部件［21］。

许多生物碱在杀死肿瘤细胞的过程中，往往同时杀死机体健康生长的细胞，伴随机体免疫力下降，最终导致整个人的死亡。对于石斛而言，基于特定的结构和药理作用，金钗石斛中的生物碱可以被用于治疗肿瘤;且金钗石斛中含有大量的植物多糖，这种多糖可以提高机体免疫能力［22］。因此，金钗石斛可以实现固本与祛邪兼得。本文将对金钗石斛中生物碱诱导mcf-7细胞凋亡进行研究，并从线粒体凋亡途径中进一步探究凋亡机制。

1 材料与方法

1.1 试验仪器

无菌超净生物安全柜、立式自动电热压力蒸汽灭菌锅、细胞培养箱(BC-J80S)、BD流式细胞仪(BD Vantage SE)、显微镜、细胞计数板、96孔细胞培养板、水浴锅、低温高速离心机、电泳仪、confocal荧光显微镜(XSP-63XDV)、漩涡震荡器等。

1.2 试验材料

金钗石斛生物碱(成都普斯生物科技有限公司)、mcf-7细胞(购于北京协和细胞库中心)、Annexin V-FITC/PI试剂盒、JC-1试剂盒、0.25%胰酶、胎牛血清、双抗溶液、1640培养基、MTT、DMSO(二甲基亚砜)、Trion-x100、RNA酶、蛋白全细胞裂解液、2×反应液、6×蛋白 Loading Buffer、分子标记 Marker、NC膜(0.45 nm 15×25 cm)、一抗体、二抗体、PAGE 4.22 ×10－12μmol/L 聚丙烯酰胺溶液、Tris盐酸 8.8、Tris盐酸6.8、APS过硫酸铵溶液、ECL显色液等。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 首先将冻存的细胞快速融化至37℃，进行细胞复苏。将0.25%胰酶消化后的细胞置于含体积分数为10%的胎牛血清和1%双抗溶液的1640培养基(使用前37℃水浴锅预热)中，分装到培养瓶中在37℃ 5%CO2饱和湿度的条件下培养细胞。24 h换一次细胞培养基。细胞传代，传代比例为1∶3，细胞培养3代以后，待细胞处于生长对数期，细胞形态最佳，生长代谢状态最活跃，即可进行后续实验。

1.3.2 MTT实验 收集对数生长期细胞，以每孔100 μL接种于96孔板中，并调整细胞悬液浓度，放置于37℃ 5%CO2的细胞培养箱中孵育，直至细胞贴壁。设计分组，各组分别加入不同浓度梯度的生物碱溶液0.1，0.15，0.2，0.25 mg/mL，每组设5 个复孔，每孔100 μL。细胞于培养箱中37 ℃ 5%CO2孵育24 h，倒置显微镜下观察细胞生长状态。细胞板中每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL，即1.21×10-14μmol/L)，于37℃ 5%CO2继续培养4 h。震荡离心，弃去培养液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，振荡溶解10 min，在490 nm处检测吸光值大小。实验铺板要设计调零空白孔(培养液、MTT、二甲基亚砜)和对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。取每组5个复孔OD值的平均值，制作柱状图进行分析。

1.3.3 流式细胞术检测细胞凋亡实验 将生长状态良好的 mcf-7细胞，用0.25%胰酶消化细胞2～3 min，加入3×10－16μmol/L的BSA防止过度消化细胞，离心收集消化后的细胞。预冷的PBS(4℃)轻轻重悬细胞一次，离心收集细胞。用1×Binding buffer 400 μL重悬细胞，向细胞悬液中加入5 μL的AV-FITC溶液，混匀避光，室温孵育15 min。进行流式细胞术上机检测前5 min，在细胞悬液中加入200 μL的1×binding buffer和5 μL PI溶液。实验设置实验组和对照组，实验组分别为药物浓度为0.1，0.2，0.25 mg/mL 3种梯度浓度进行实验。对照组分为空白对照组、AV-FITC单染色对照组、PI单染色对照组。进行流式细胞术上机需要有一定的顺序，按着AV-FITC对照组、PI对照组、空白对照组的顺序上机检测。

1.3.4 采用流式细胞仪检测细胞周期 取1管细胞浓度大于1×106的细胞悬液，用预冷的1×PBS缓冲液洗涤细胞3次，离心并弃掉上清液。以0.5 mL 1×PBS重悬细胞，迅速打入3.5 mL 1.52×10－11μmol/L预冷的乙醇中，吹打均匀，4℃储存过夜。离心固定过夜的细胞，弃掉上层乙醇液体，用1×PBS缓冲液洗涤细胞3次。用含有2 mg RNase A的10 μL PI/Triton X-100染色液重悬细胞，37℃染色15 min。应用流式细胞仪检测mcf-7细胞周期的阻滞周期并分析。

1.3.5 Confocal(荧光共聚焦显微镜)观察细胞线粒体去极化现象 生长状态良好的mcf-7细胞经过不含有EDTA的胰酶消化后，制备成细胞浓度为1×106的细胞悬液，铺板于直径5 cm的Confocal细胞专用板中，加培养液继续培养，待细胞贴壁生长。24 h后，弃掉培养液，用PBS轻轻洗涤细胞2次。设置实验对照组和3个实验组，在对照组中加入1 mL细胞培养基，3个实验组中分别加入0.125%，0.25%，0.5%的生物碱溶液1 mL，继续培养24 h。取出细胞板，弃掉含有生物碱的培养液。在实验组和空白组的细胞板中边震荡边加入1 mL终浓度为3.83*10－18μmol/L的JC-1溶液，避光孵育30 min，进行线粒体染色。染色过后用PBS轻轻洗涤细胞3～5次。吸走PBS洗涤液，加入细胞培养基，Confocal上镜观察细胞线粒体膜电位变化。

1.3.6 Westernblot(免疫印迹法)caspase-3蛋白表达 配置12%10 mL的分离胶和5%4 mL的浓缩胶，混匀后灌胶，封胶。将细胞酶解消化并收集，制备细胞浓度大于1×106的细胞悬液。用PBS洗涤细胞1次，吸尽上清液后，按照200万细胞加入50 μL的比例加入全细胞裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解30 min。裂解过程中，涡旋震荡3～4次，每次10 s。裂解完毕后，细胞4℃离心20 min。吸取上清液，转移至新的离心管中，放置冰上待用。

分别吸取10 μL预染低分子量蛋白质和加入marker的蛋白裂解液，依次注入泳道内。电泳2 h。在湿法转膜过程中，恒定电流400 mA，转膜4 h。将膜从电转夹中取出，用去离子水和PBST洗涤NC膜3次，每次5 min。漂洗过后的NC膜放置于封闭液中，缓慢摇晃封闭1 h。

把经过封闭的NC膜与按照1∶500(检测全长caspase-3)/1∶250(检测被剪切的cleaved caspase-3)混合稀释好的小鼠单克隆抗体4℃缓慢摇动过夜。一抗孵育过后，用PBST洗涤NC膜3次，每次10 min。结合二抗体按照1∶1 000的比例稀释辣根过氧化物酶，在杂交袋里室温孵育2 h，洗涤NC膜3次，每次10 min。ECL显色检测，并分别曝光全长caspase-3和被剪切的cleaved caspase-3的蛋白表达量，显影冲洗。

2 结果与讨论

2.1 MTT细胞生长曲线

结果显示，不同浓度的金钗石斛生物碱对mcf-7细胞作用，随着浓度的增大细胞增殖活力受到抑制，细胞活力明显下降。浓度越大，细胞活力越差，抑制越明显，有依赖剂量效应。生物碱浓度为0.1%时对细胞活力影响较明显，0.25%为最大效应。

2.2 流式细胞术检测细胞凋亡

图中，A图为空白对照实验组，没有进行诱导的mcf-7细胞存活率较好，早期凋亡率为0.4%，中晚期凋亡率为0.11%(表1)，具有可参考对照价值。图B为浓度0.1%的生物碱诱导mcf-7细胞，24 h后细胞发生早期凋亡率为11.54%，中晚期凋亡率为 5.48%。图 C为浓度0.2%的生物碱诱导mcf-7细胞，结果发现24 h后细胞的早期凋亡率为18.69%，中晚期凋亡率为15.58%。图D中的细胞早期凋亡率达到26.98%，接近30%，中晚期凋亡率为42.43%，已经接近50%，促使细胞中晚期凋亡率达到一半的生物碱浓度为0.25%。实验组的细胞总体凋亡率分别为17.02%，34.27%，69.41%。随着生物碱浓度的增大，细胞总体凋亡率呈现上升趋势，接近70%。mcf-7细胞对金钗石斛生物碱有剂量效应关系，显示出促进凋亡效应。表明生物碱可显著诱导乳腺癌细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。

图1 不同浓度生物碱对mcf-7细胞抑制增殖作用Fig.1 The inhibitory effect of dendrobine of different concentration on mcf-7 cells

表1 流式细胞检测术检测mcf-7细胞凋亡率Tab.1 The apoptosis rate of mcf-7 with flow cytometry

图2 流式细胞检测术检测mcf-7细胞凋亡率Fig.2 The apoptosis rate of mcf-7 with flow cytometry

2.3 采用流式细胞仪检测细胞周期

结果显示，金钗石斛生物碱抑制mcf-7肿瘤细胞的增殖是通过抑制细胞周期来实现的。随着药物浓度的增加，细胞周期G0/G1期比例增加，说明金钗石斛生物碱对mcf-7细胞增殖的抑制作用途径为阻滞细胞G0/G1期。在G0/G1期是细胞复制的重要时期，细胞的RNA，如mRNA、tRNA、rRNA，蛋白和糖原的合成等。可见，金钗石斛生物碱作用mcf-7细胞抑制其肿瘤细胞的扩增，在G0/G1期起到了良好的抑制作用，mcf-7细胞对生物碱有依赖作用，浓度越大，抑制效果越好。

图3 流式细胞仪检测mcf-7细胞周期Fig.3 The cell cycle of mcf-7 with flow cytometry

2.4 Confocal(荧光共聚焦显微镜)观察细胞线粒体去极化现象

金钗石斛生物碱诱导mcf-7细胞凋亡24 h，凋亡发生过程中，线粒体膜电位去极化的过程出现，如图4可见，细胞线粒体膜电位的改变引起染色红绿比例逐渐减小，随着不同浓度金钗石斛生物碱的作用，浓度越大，去极化现象越明显，mcf-7细胞发生早期凋亡越明显。可见，线粒体膜去极化现象的发生是细胞凋亡的早期表现，一旦线粒体膜电位损耗，细胞就会进入不可逆的凋亡过程。抑制线粒体膜电位去极化现象的发生，就会阻抑细胞凋亡的发生，说明线粒体膜电位去极化现象为凋亡的特征性改变。经对金钗石斛生物碱诱导凋亡后的mcf-7细胞进行流式细胞术分析检测也表明，线粒体膜电位的去极化现象要早于胞膜磷脂酰丝氨酸外翻，早于凋亡时细胞的形态学改变、蛋白酶caspase-3激活等变化，提示线粒体膜电位下降是凋亡早期阶段。

图4 JC-1细胞线粒体染色去极化现象Fig.4 The mitochondrial depolarization of mcf-7

2.5 Westernbolt(免疫印迹法)caspase-3蛋白表达

Mcf-7细胞经过金钗石斛生物碱的诱导，24 h后，细胞发生早期凋亡现象。对细胞进行westernblot检测，发现了procaspase-3的蛋白表达条带——cleaved-caspase-3的清晰条带。细胞凋亡现象的发生，是由于线粒体去极化导致线粒体膜通透性增加，一些可溶性蛋白会释放到细胞浆中，细胞色素C为信号传导机制的激活因子，激活以酶原形式存在的procaspase-3、caspase-3为细胞凋亡的执行分子，故启动了细胞死亡程序［23-26］。如图5所示，对细胞全蛋白液体进行检测，不同浓度稀释caspase-3抗体，分别检测全长caspase-3和被剪切的17 ku的cleaved caspase-3。图中32 ku的procaspase-3蛋白表达量条带清晰可见，不同浓度的金钗石斛生物碱诱导mcf-7细胞，随着浓度的增加细胞中32 ku没有被激活的凋亡执行基因蛋白表达量会减少。作用时间相同(24 h)的条件下，浓度越大，细胞的早期凋亡事件发生的越明显，mcf-7细胞中全细胞蛋白液检测到被剪切的17 ku大小的caspase-3基因蛋白表达条带，蛋白条带完整可见，生物碱浓度的增加使得procaspase-3激活，剪切底物为17 ku caspase-3基因蛋白表达条带。金钗石斛生物碱可使mcf-7细胞发生细胞凋亡，且凋亡机制进一步确认为线粒体内通路机制导致细胞最终死亡。

图5 不同浓度生物碱处理mcf-7细胞24 h对caspase-3蛋白表达的影响Fig.5 The expression lever of caspase-3 on mcf-7 cells

3 结论与展望

金钗石斛生物碱对乳腺癌肿瘤细胞生长具有抑制作用，且具有明显的促凋亡效应。实验结果显示金钗石斛生物碱能使mcf-7细胞通过线粒体途径发生细胞凋亡，且有细胞色素C释放，并激活procaspase-3启动了细胞的死亡程序。

对于金钗石斛生物碱的抗肿瘤作用，可以进一步联合石斛多糖的抗氧化和提高机体免疫力效应，通过对健康机体细胞与肿瘤细胞联合作用，进行对比研究，在促进肿瘤细胞凋亡的同时提高机体免疫力，增强抗癌治疗中对机体免疫力的伤害。

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