珍稀药材三叶青种质资源遗传多样性的ISSR分析

朱 波，华金渭，刘 昆，吉庆勇，吴剑锋，齐 川

(1.浙江省丽水市农业科学研究院，浙江 丽水 323000;2.浙江中医药大学，浙江 杭州 310053;3.浙江省丽水市中药材产业发展中心，浙江 丽水 323000)

三叶青是民间珍稀中药材，又名金线吊葫芦、石老鼠、蛇附子、石猴子、石抱子、拦山虎、雷胆子、破石珠、土经丸，原植物为葡萄科(Vitaceae)崖爬藤属(Tetrastigma planch)植物三叶崖爬藤(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)，块根或全草入药，主要分布于我国浙江、湖北、湖南、江西、重庆、四川、广东、福建、广西、贵州等地，具有清热解毒，祛风化痰，活血止痛的功能，临床主要用于治疗高热惊厥、腹痛、肺炎、哮喘、肝炎、肿瘤等症［1-4］。目前三叶青的研究报道主要集中于生药形态学、组织培养、化学成分、药理及临床应用等［5-10］，而三叶青种质资源遗传多样性研究鲜有报道。

ISSR(inter-simple sequence repeat)分子标记即微卫星间DNA多态性，是由Zietkiewicz等［11］于1994年提出创建的分子标记技术，该技术稳定性好，多态性高，实验操作简便且快速，还可以揭示基因组水平的某些特征，且呈孟德尔式遗传，该技术一经问世就被广泛用于遗传多样性分析、品种分子鉴定和系统发生关系等研究［12-18］。本试验收集全国三叶青主产区种质资源24份，提取基因组DNA，筛选引物进行ISSR-PCR扩增，分析三叶青种质资源遗传多样性，以期为三叶青遗传图谱构建与分子辅助选育新品种提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

2012年12月至2013年11月，收集浙江、江西、福建、广西、湖南、湖北等三叶青主分布区种质资源24份，除湖南怀化种质为人工栽培种质外，其余23份均为野生种质资源(表1)，全部种植于浙江省丽水市农业科学研究院中药材资源圃，原植物由浙江农林大学斯金平教授鉴定为葡萄科植物三叶崖爬藤(Tetrastigma hemsleyanum)，2014年6月，选取不同种源三叶青新鲜叶片，每份样品随机选取10个单株，洗净晾干，待用。

表1 供试三叶青编号与种源地Tab.1 Numbers and provenances of Tetrastigma hemsleyanum

1.2 仪器和试剂

1.2.1 仪器 5424R型高速离心机(德国Eppendorf公司)，nexus SX1型PCR扩增仪(德国Eppendorf公司)，Milli-Q Academic型超纯水仪(美国Millipore公司)，BIO-BEST凝胶成像系统(美国SIM公司)，SpectraMax PLUS384型连续波长酶标仪(美国MD公司)，DYY-8C型电泳仪(北京六一仪器厂)，AR2140型分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)，HH-4型数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)，GR60DA型自动压力蒸汽灭菌锅(厦门致微仪器有限公司)。

1.2.2 试剂 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、三羟甲基氨基甲烷(Tris-base)、β-巯基乙醇、硼酸、氯仿、无水乙醇、异丙醇、氯化钠、琼脂糖、异硫氰酸胍、异戊醇、浓盐酸、DNA Marker、Taq聚合酶、dNTPs等试剂购自天根生化科技(北京)有限公司与百维生物(上海)科技有限公司，ISSR引物购自美国Invitrogen公司。

1.3 试验方法

1.3.1 基因组DNA的提取 参照顾红雅等［19］的方法并加以改进，本试验所用DNA以混合DNA样品代表种质DNA样品，具体步骤如下:①将1 mL CTAB提取液(2%CTAB，2%PVP，100 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，25 mmol/L EDTA，2.0 mol/L NaCl)加入到2 mL 离心管中，65 ℃水浴30 min预热;②预热期间，取1～2 g样品置于研钵中，加入适量PVP，液氮中研磨至粉末;③将适量粉末迅速转入盛有1.2 mL TNE(100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，20 mmol/L EDTA，0.25 mol/L NaCl，2% β-巯基乙醇)的离心管中，充分震荡混匀，65℃水浴10 min，期间摇晃2次，室温10 000 r/min离心10 min，去上清;④加入预热好的CTAB提取液1 mL，混匀65℃水浴40 min，期间颠倒混匀3～5次，12 000 r/min离心10 min;⑤取上清，加入等体积氯仿-异戊醇(V∶V=24∶1)，充分颠倒混匀，10 000 r/min离心10 min，取上清，重复1次;⑥加入等体积异丙醇，轻缓颠倒混匀，－20℃冰箱放置30 min，12 000 r/min离心10 min，弃上清;⑦加入1 mL体积分数70%乙醇漂洗2次;⑧室温下微干，加入30～50 μL TE缓冲液;⑨加入终浓度为20 μg/mL的RNaseA，37℃水浴30 min。

1.3.2 引物筛选与体系优化 在24个样品中挑选3个样品进行正交试验体系优化与引物筛选。从101个引物中筛选出扩增条带清晰、多态性好和反应稳定的22个引物(表2)，对24份三叶青样品进行ISSRPCR扩增。正交试验优化的扩增体系与循环参数如下:20 μL反应体系中，Taq酶用量0.5 U，模版DNA 20 ng，dNTPs 0.20 mmol/L，引物0.4 μmol/L，2 μL 10 ×Buffer缓冲液(Mg2+浓度1.5 mmol/L);PCR 扩增程序为:94℃ 4 min;94℃变性30 s，48～52℃复性45 s，72℃延伸2 min，35个循环;72℃延伸7 min，4℃保存。

1.4 数据统计与分析

根据分子标记在相同电泳迁移率(相同分子量片段)条带的有无统计得到所有位点的二元数据，有DNA扩增带记为1，无带记为0。利用NTSYSpc2.10e软件计算样品之间的遗传距离和相似系数，根据遗传距离用UPGMA法(Unweighted pair group mean average)聚类分析，构建系统树。

2 结果与分析

2.1 扩增产物的多态性分析

筛选的22个引物对24份样品进行ISSR扩增，共扩增出条带169条，其中多态性条带77条，平均多态性比例为46.7%，单条引物扩增总带数5～11条，平均扩增7.7条，扩增多态性条带2～5条，平均扩增3.5条，详见表2。扩增出的DNA片段集中在450～2 200 bp，其中，多态性比例最多的引物为P27，达到 66.7%，最低的为引物 P2，P6 与 Xp31，均为33.3%(表 2、图 1)。

2.2 相似系数分析

利用NTsys2.10e软件分析得到24份样品间的遗传相似系数矩阵，遗传相似系数越大表明样品间亲缘关系最近。结果表明:供试三叶青种质资源相似系数值在0.77～0.99(表3)，亲缘关系最近为浙江莲都-Ⅰ与浙江莲都-Ⅱ种质，相似系数最小存在于浙江庆元种质与广西钟山种质之间。

表2 供试ISSR引物及PCR扩增的多态性Tab.2 Primers selected and polymorphic bands amplified by PCR

图1 引物xp14对不同种源三叶青ISSR扩增图(箭头所指多态性位点)Fig.1 Bands amplified by ISSR under xp14 primer(the arrow pointing polymorphic locus)

2.3 聚类分析

利用UPGMA法对24份三叶青种质资源样品进行聚类分析，建立聚类分支树状(图2)。供试材料以相似系数0.847为分类界限，将24份三叶青种质资源分成4类:第Ⅰ类有10个种质，分别为1、2、5、6、7、8、10、11、23 和 24，本类以浙江种质为主，8 份浙江种质全部归于此类，此外还包括江西瑞金与重庆綦江种质。从相似系数看，浙江种质较明显区别于其他省份种质，其中江西瑞金种质为人工栽培种质，其种源地来自浙江，故归属此类;第Ⅱ类有11个种质，分别为9、12、13、14、15、16、17、19、20、21和22，本类以江西、广西、湖北、湖南种质为主，大部分上述来源种质聚在一起;第Ⅲ类有2个种质，分别为湖南怀化与广西钟山，湖南怀化种质非野生资源，其种源地有待进一步考察;第Ⅳ类仅有一个种质，为贵州种质。

表3 ISSR标记的24份种质资源间的相似系数Tab.3 Similarity coefficient of 24 germplasm resources by ISSR

图2 三叶青种质资源聚类图Fig.2 Dendrogram of 24 Tetrastigma hemsleyanum germplasms

3 讨论

种质资源遗传多样性分析是研究物种起源进化、发现新的基因资源、改良现有育种材料的基础性工作。分子标记是从DNA水平上揭示品种及种群间差异性和相关性的有效工具之一，可以用来确定样本材料之间的遗传多样性和亲缘关系，通过聚类分析可以划分出优势种群，提高自然种群优势的应用效率，对种质资源保护和新品种选育具有重要意义［20］。ISSR分子标记技术结合了RAPD标记和SSR标记的优点，在同一水平上，更具可靠性、重复性高，被广泛应用于植物种内遗传多样性的研究［17］。由于三叶青遗传背景复杂和遗传基础理论研究薄弱，加之生长周期长和收集种质数目的增多，采用传统的分析方法和形态指标难以有效区分种质，更无法在较短时间内研究种质资源的遗传多样性和种质间的亲缘关系。本试验在收集全国主产区三叶青种质资源的基础上，开展ISSR分子标记研究，分析三叶青种质资源的多样性与种质间的亲缘关系，以期为三叶青种质资源遗传结构与构建核心种质资源库奠定基础。

从ISSR-PCR扩增结果看，24份三叶青种质资源平均多态性比例为46.7%，表明三叶青种质资源存在一定的遗传多样性，但相比和志娇［17］、杨美玲［21］等报道的多态性比例较低，原因可能是本试验所取材料均为一个种，属于种内变异，相比种间或居群间变异小，其次可能浙江种质占到了所有种质的三分之一，且江西瑞金种质的种源地也是来自浙江，种源地组成较单一的原因所致。从相似系数看种质间亲缘关系，亲缘关系最近为浙江莲都-Ⅰ与浙江莲都-Ⅱ种质，表明浙江莲都-Ⅰ与浙江莲都-Ⅱ种质确为浙江莲都本地野生种质，来源于同一种源地。亲缘关系最远的为浙江庆元种质与广西钟山种质，浙江庆元位于浙江西南部，广西钟山位于广西东北部，均属于长江中下游地区，此地区以丘陵地形为主，包括江南丘陵、浙闽丘陵与两广丘陵，浙江庆元与广西钟山分属浙闽丘陵与两广丘陵，丘陵地形以山地居多，生物群落分布复杂多样，加之庆元百山祖地区为国家级自然保护区，复杂的地形地貌可能影响了种群间的基因交流，这可能是浙江庆元与广西钟山种质亲缘关系较远的主要原因。从地理位置与相似系数看，种质资源间亲缘关系的远近不全由地理距离决定，生态气候、地形地貌、海拔经纬度、群落分布等自然因素及人类活动等社会因素均会对三叶青种质资源基因交流产生影响，从而影响亲缘关系。

用UPGMA法将24份三叶青种质资源分成4大类，第Ⅰ类以浙江种质为主，第Ⅱ类以江西、广西、湖北、湖南种质为主，第Ⅲ类包括湖南怀化与广西钟山2个种质，调查发现，湖南怀化种质非野生资源，推测其种源地可能位于广西与湖南交界处，但最终种源地还需综合生物学特性、农艺性状、化学成分等试验确定;第Ⅳ类仅有一个种质，为贵州种质，此种质种源地已知位于黔西南地区，此地区位于云贵高原境内，海拔、经纬度、生态气候等因子区别于其他23份种质，这可能是贵州种质单独聚类的原因。

综上所述，ISSR分子标记适用于三叶青种质资源遗传多样性与亲缘关系分析，全国主产区24份三叶青种质资源表现出一定的遗传多样性，为三叶青品种改良奠定了一定的遗传基础。植物的农艺性状为基因表达与环境互作共同作用的表现，浙江三叶青表现均表现出茎细，圆形的形态特征，而其他种质茎较粗且为方形，结果显示可以进行下一步农艺性状、化学成分等指标与特异性DNA片段的相关性研究，最终实现通过克隆目标基因控制药材性状的目的。通过相似系数分析了三叶青种质间的亲缘关系，同时通过遗传聚类了解三叶青遗传变异在地理上的分布格局对于制定科学的保护策略并促进其开发利用具有极为重要的作用。

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