大豆脂肪氧化酶-Ⅲ酶联免疫检测试剂盒的制备及其稳定性研究

李亚璞（河北省科学院生物研究所，河北石家庄050081）



大豆脂肪氧化酶-Ⅲ酶联免疫检测试剂盒的制备及其稳定性研究

李亚璞
（河北省科学院生物研究所，河北石家庄050081）

摘要：为了实现对脂肪氧化酶-Ⅲ缺失大豆材料的快速筛选，通过双抗体夹心法利用大豆脂肪氧化酶-Ⅲ的单抗及脂肪氧化酶多抗制备了大豆脂肪氧化酶-Ⅲ的酶联免疫检测试剂盒。结果表明，该试剂盒在2～8℃条件下可以保存6个月，稳定性良好，并可实现对脂肪氧化酶-Ⅲ缺失大豆材料的快速检测。

关键词：大豆；脂肪氧化酶-Ⅲ；单克隆抗体；多克隆抗体；酶联免疫试剂盒

脂肪氧化酶（lipoxygenase，简写Lox）能专一催化多元不饱和脂肪酸加氧反应，生成具有共轭双键的脂肪氢过氧化物，再经裂解酶分解生成短碳链的醇、酮和醛类等挥发性物质，导致大豆及其制品产生豆腥味，限制了大豆及其制品的广泛应用。该酶于1932年首次在大豆中被发现，分别命名为脂肪氧化酶-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ[1]。目前，常规消除豆腥味的方法有物理法和化学法，但解决这一问题的根本途径还是育种法。因此，选育脂肪氧化酶缺失的大豆品种是当前研究的热点。

1971年，Engvall和Perlmann报道了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）在免疫球蛋白（IgG）定量分析中的应用，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成测定样本中微量物质的一种定量方法，其基本原理是抗原（抗体）的固相化及抗原（抗体）的酶标记。ELISA双抗体夹心法的原理是将特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检样本中的相应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体，与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物，加底物显色，利用显色的深浅可以判断抗原含量或有无。近年来，随着免疫方法学的迅速发展，因其具有特异性强、敏感性高、检测方便快速等优点，酶联免疫测定技术正愈来愈广泛地应用于对样品材料中痕量物质的检测。利用抗原与抗体的特异专一性亲和反应鉴定大豆脂肪氧化酶同工酶，可成功地进行群体规模Lox类型的筛选。利用这一技术，笔者研制出一种测定大豆脂肪氧化酶-Ⅲ的免疫快速检测试剂盒，用于筛选大豆脂肪氧化酶同工酶缺失的新材料，对大豆育种具有十分重要的意义。

1　材料与方法

1.1试验材料

试验所用大豆来自于河北省农科院粮油作物研究所；分泌大豆脂肪氧化酶-Ⅲ特异性抗体的细胞株由河北省科学院生物研究所细胞生化室保藏。供试动物为BALB/c小鼠、新西兰大白兔，均购自河北医科大学实验动物中心。

试验主要试剂有Lipoxidase preparation、TypeI-B （Sigma L7395-15MU）、Tween-20、Glycerol（Solarbio Reagent Grade），酶稳定剂、酶联稀释液（泰天和公司），辣根过氧化物酶、四甲基联苯胺二盐酸盐、牛血清白蛋白（BSA）、酪蛋白、海藻糖、完全佐剂、不完全佐剂（Sigma公司），柠檬酸、过碘酸钠、乙二醇、硼氢化钠（国产分析纯），超纯水（自制）。

主要试验仪器有倒置显微镜（Olympus），移液枪、洗板机（Thermo），酶标仪（美国Bio-TEK），二氧化碳恒温培养箱（SANYO公司），超速低温离心机（HITACHI），酶标板（Costar），其他仪器均为国产普通仪器。

1.2试验方法

1.2.1抗脂肪氧化酶多克隆抗体的制备及纯化称量Lipoxidase粉末，用超纯水稀释成1 mg/mL，按一定剂量分装后对新西兰大白兔进行免疫反应，制备抗脂肪氧化酶多克隆抗体。取一定量的抗脂肪氧化酶多克隆抗体，在血清中加入硫酸铵，加入量为0.313 g/mL，搅拌30 min，取沉淀溶于0.01 mol/L的PBS中，透析过夜，取出并测定效价。

1.2.2抗脂肪氧化酶单克隆抗体的制备及纯化复苏抗脂肪氧化酶-Ⅲ细胞株，细胞经过培养后，注入小鼠腹腔诱生腹水，制备抗脂肪氧化酶-Ⅲ的单克隆抗体。腹水采用辛酸-硫酸铵法纯化，用SDS-PAGE法对抗体纯度进行鉴定，并对纯化抗体进行效价测定、亲和力测定和交叉反应测定。

1.2.3单克隆抗体的酶标及酶标抗体工作浓度的测定以辣根过氧化物酶（HRP）采用改良过碘酸钠法标记抗体[2-3]，并通过间接ELISA法对标酶抗体进行最适工作浓度测定。

1.2.4大豆脂肪氧化酶-ⅢELISA试剂盒的稳定性测试（1）多克隆抗体在酶标板上的固定技术和保存期测定。分别以10、5、2.5、1.25 g/mL的抗体包被酶标板，筛选最佳的抗体包被浓度。将处理好的酶标板条置于铝箔袋中抽真空，然后加干燥剂密闭包装，分别置于4℃、37℃条件下做保存期测试。（2）酶标抗体稀释液的保存期测定，研究保护液对低浓度酶结合物长期保存稳定性的影响。（3）试剂盒中其他液体的保存期测定。试剂盒中其他液体包括洗液、标准品溶液、样品处理液、样品稀释液和显色液，这些试剂的保存期测定在4℃下进行，定期取出观察是否有染菌现象，连续观察6个月并对其进行ELISA试验测定光吸收值。（4）试剂盒保存期测定。试剂盒在2～8℃下的稳定性试验方案如下：取出新制备的试剂盒于4℃冰箱中保存，分别于第0、1、2、3、4、5和6个月将试剂盒取出对大豆特殊材料进行检测，以验证试剂盒的准确性。

2　结果与分析

2.1多克隆抗体纯化后效价

新西兰大白兔经过4次免疫后取血，离心后取上清即为抗脂氧酶多克隆抗体，该抗体经饱和硫酸铵法纯化后测定效价为1︰1638400，蛋白浓度为32mg/mL。

2.2单克隆抗体纯化后效价

单抗经辛酸-硫酸铵法纯化后，用凝胶成像分析纯度为86%，蛋白含量为16.8 mg/mL；抗体效价为1︰1 638 400，与只含有Lox-Ⅰ、Lox-Ⅱ的试验材料反应，效价仅为1︰51 200，交叉较小；抗体亲和力指数在109以上。

2.3标酶抗体的最适工作浓度

采用间接ELISA法测定最佳的酶标抗体工作浓度，以Lox-Ⅲ的抗原包板，确定该酶标抗体最高的稀释倍数为1︰800 000，以3%的BSA和10%的BSA包板，确定该酶标抗体最低的稀释倍数为1︰3 200，酶标抗体最佳的工作浓度为1︰400 000；方阵滴定法测定酶标抗体在ELISA试剂盒中实际的工作浓度为1︰5 000，这样既可以节省酶标抗体，又可以使该酶标抗体在酶标稀释液中较长时间保存。

2.4大豆脂肪氧化酶-ⅢELISA试剂盒的稳定性

2.4.1试剂盒的组成该试剂盒主要由96孔酶标板、酶标抗体稀释液、浓缩洗液、标准品溶液、样品处理液、样品稀释液，显色液和终止液等8种液体组成。

2.4.2酶标板保护剂筛选及保存期经过方阵试验，最佳的抗体包被浓度为5 g/mL；酶标板经过稳定剂处理，37℃加速破坏3 d，与4℃放置的板子相比，读值下降了8.51%，符合试剂盒规定要求，酶标板可以在4℃条件下保存6个月。

2.4.3酶标抗体稀释液配方的筛选及保存期将酶标抗体稀释液在4℃下保存6个月，其活性降低了18%；而在37℃加速试验的第4天，其活性降低了16.7%，二者下降率均在20%以内，这说明该酶标抗体稀释液可以将酶标抗体稳定保存6个月。

2.4.4试剂盒中其他液体的保存期试剂盒的稳定性除了与关键试剂密切相关外，试剂盒中的其他试剂对试剂盒的稳定性也有一定的影响[4-5]。试验测定结果显示，在4℃下保存6个月，试剂盒中的洗液、标准品溶液、样品处理液、样品稀释液和显色液无染菌现象，而且其光吸收值变化不大。这说明试剂盒中其他液体对试剂盒的影响不大，只要各种液体在配置过程中按规定无菌操作，以上几种液体可以较长时间保存。

表1　试剂盒的准确性测定

2.4.5试剂盒准确性由表1可知，在4℃下保存6个月，试剂盒的光吸收值变化不大。这说明该试剂盒在2～8℃条件下可以保存6个月，稳定性良好。

3　结论

试验通过对试剂盒中关键试剂以及试剂盒整体的加速试验，该Lox-Ⅲ酶联免疫检测试剂盒在2～8℃条件下可以保存6个月，稳定性良好，能够定性检测出含有脂氧酶-Ⅲ的大豆材料。研究结果显示，该试剂盒中试剂稳定性良好，不仅可以长时间保存，而且对储存及运输条件的要求也较低，可极大地提高试剂盒的使用范围。

参考文献：

[1]张瑛，张磊，吴敬德，等.植物脂肪氧化酶同功酶快速检测技术在无豆腥味大豆育种上的应用研究[J].大豆科学，2003，2（1）：50-53.

[2]骆加理，沈炳贵，宋光承，等.辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体的简易方法[J].生物化学与生物物理学报，1981，13（1）：1-7.

[3]张趁华，蔡家利.兔抗小鼠IgG-HRP酶标抗体的制备及应用[J].莆田学院学报，2011，18（2）：19-23.

[4]宋惠娟，向凌云，史楠，等.丙型肝炎病毒抗体酶联免疫诊断试剂中酶结合物稀释液对酶结合物稳定性影响的研究[J].药品评价，2005，2（5）：351-353.

[5] Kolosova A Y，Shim W B，Yang Z Y，et al. Direct competitive ELISA based on a monoclonal antibody for detection of aflatoxin B1. Stabilization of ELISA kit components and application to grain samples [J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry，2006，384（1）：286 -289.

（责任编辑：成平）

Preparation of ELISA Kit for Soybean Lipoxygenase-Ⅲand Its Stability

LI Ya-pu
（Institute of Biology, Hebei Academy of Science, Shijiazhuang 050081, PRC）

Abstract：In order to realize the rapid screening of soybean material which lacking lipoxygenase-Ⅲ, an ELISA kit was made by double antibody sandwich method which utilizing the polyclonal antibodies and monoclonal antibodies specific for soybean lipoxygenase-Ⅲ. The results showed that the effective time of the ELISA kit was six months, which stored at 2～8℃, and its stability and accuracy were good, it can be used for quick detecting for soybean material which lack lipoxygenase-Ⅲ.

Key words：soybean; lipoxygenase-Ⅲ; monoclonal antibody; polyclonal antibody; ELISA kit

作者简介：李亚璞（1980-），女，河北鹿泉市人，助理研究员，主要从事免疫检测技术研究。

收稿日期：2015-04-23

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.07.030

中图分类号：R446.61

文献标识码：A

文章编号：1006-060X（2015）07-0102-03