亚低温联合促红细胞生成素治疗足月儿缺氧缺血性脑病的安全性观察

林碧云 顾秋芳 张 鹏 程国强 邵肖梅 王来栓 周文浩



·论著·

亚低温联合促红细胞生成素治疗足月儿缺氧缺血性脑病的安全性观察

林碧云1,2顾秋芳1,2张 鹏1程国强1邵肖梅1王来栓1周文浩1

目的 研究亚低温联合促红细胞生成素(EPO)治疗中、重度足月儿缺氧缺血性脑病(HIE)的安全性，为开展多中心研究亚低温联合EPO治疗足月儿HIE的疗效奠定基础。方法 对2012年2月至2015年3月收住复旦大学附属儿科医院NICU满足亚低温治疗标准并知情同意下的中、重度足月儿HIE随机分组。实验组给予亚低温治疗72 h联合EPO(1 000 U·kg-1,静脉滴注, 隔天1次，14 d)；对照组给予亚低温治疗72 h和与EPO同等剂量、同样给药方法的生理盐水。监测患儿治疗期间的生命体征，治疗期间放弃治疗事件，记录亚低温治疗前、亚低温治疗结束时、EPO疗程结束后的血生化指标，观察严重心律失常、大静脉血栓、不可纠正的低血压、死亡等严重不良事件，低血压、凝血功能障碍、肾功能异常等一般不良事件。比较两组间不良事件发生率的差异。结果 44例足月儿HIE进入本文安全性观察，其中实验组25例，对照组19例。3例重度HIE足月儿(实验组2例，对照组1例)亚低温治疗期间主动放弃治疗。两组在EPO相关不良事件血生化指标Hb、RBC、 Hct和 PLT差异均无统计学意义；两组在HIE并发症及其治疗严重和一般不良事件的发生率差异均无统计学意义。结论 亚低温联合EPO治疗中、重度足月儿HIE未发生与治疗相关的严重不良事件，安全可行。

缺氧缺血性脑病; 新生儿； 亚低温； 促红细胞生成素； 安全性

中、重度缺氧缺血性脑病(HIE)是导致新生儿死亡和远期严重伤残的主要病因之一[1, 2]。尽管窒息后的亚低温治疗可以显著降低HIE病死率、18月龄的伤残发生率并且改善学龄儿童的认知功能[3]，但是仍然有约50%经过亚低温治疗的HIE患儿死亡或发生严重伤残[4]。最新的国家儿童保健和人类发育研究所(NICHD)多中心研究表明延长低温时间至120 h或维持32℃并持续72 h均不能降低HIE的病死率且可能增加不良事件的发生率[3, 5]。而在标准亚低温治疗的基础上添加能透过血脑屏障的神经保护剂促红细胞生成素(EPO)成为近年研究的热点之一。EPO是一种分子量为34 kDa的糖蛋白激素，主要功能是促进红细胞生成，近年来研究发现其还有许多其他生理功能，其中在动物实验中证实其具有脑保护作用引起了广泛关注[6]，多项动物实验均表明EPO安全性较好且对HIE有不同程度的疗效[7～12]。外源性使用EPO可能导致红细胞增多、血栓形成和血小板活性增强等不良事件[13]。有小样本的临床试验证实，重复、低剂量重组人促红细胞生成素(rh-EPO)治疗中度HIE患儿可减少远期神经系统后遗症的发生，且未发现明显的不良事件[14]。本文在标准亚低温治疗的基础上添加EPO治疗足月儿HIE，观察联合治疗的安全性。

1 方法

1.1 研究设计 本研究为随机、单盲、安慰剂对照的试验，获得复旦大学附属儿科医院(我院)伦理委员会的批准。研究对象为中、重度足月儿HIE，于生后6 h 内行全身标准亚低温治疗，实验组和对照组于生后12 h内分别静脉滴注EPO和生理盐水，观察亚低温联合EPO治疗的安全性。

1.2 HIE诊断标准 符合中华医学会儿科学分会新生儿学组制定的HIE诊断标准[15]，或振幅整合脑电图(aEEG)异常，至少描记20 min并存在以下任意1项，①严重异常：上边界电压≤10 μV，②中度异常：上边界电压>10 μV和下边界电压<5 μV，③惊厥发作。

1.3 研究对象纳入标准[16]①胎龄≥36周，出生体重≥2 500 g，性别不限；②生后60 min内动脉血气分析pH<7.10或BE≤-16 mmol·L-1或Apgar评分生后1 min<3分，5 min<5分或复苏时间>15 min；③生后6 h内出现脑损伤表现：aEEG异常或存在神经系统症状和体征(惊厥、昏迷、肌张力低下、反射异常和呼吸不规律等)；④生后6 h内行亚低温治疗。

1.4 研究对象排除标准[16]①严重先天性疾病：先天畸形、先天性代谢异常；②合并严重感染：宫内感染、高度疑似产前和产时感染；③其他颅内损伤：严重颅内出血、颅骨骨折；④临床有自发性出血倾向或PLT<50×109·L-1。⑤严重失血性贫血(Hb<90 g·L-1)。

1.5 随机化和盲法 符合本文纳入和排除标准的足月儿，在家长知情同意下，依据试验前确定的随机序列(随机数字表法)分为实验组和对照组。治疗方案实施和治疗期间的安全性指标观察均由课题组专人完成。本研究只对生后18个月神经发育结局随访时设盲。

1.6 治疗方案 实验组和对照组均于生后6 h内行全身性亚低温基础治疗。亚低温治疗具体方法见文献[15]。实验组在生后12 h内静脉滴注1 000 U·kg-1的rh-EPO(北京四环生物制药有限公司,批号S19991024)，隔天1次，共7次(疗程为14 d)；对照组在生后12 h内静脉滴注1 mL·kg-1生理盐水, 隔天1次，共7次(疗程为14 d)。

1.7 亚低温治疗的退组方案 全身亚低温治疗期间，存在以下任一情况立即终止亚低温治疗[17]：①低血压(平均动脉压<30 mmHg)经扩容、多巴胺等治疗无效者；②严重心律失常；③持续肺动脉高压难以纠正；④临床和实验室检查诊断为严重感染(参照中华医学会儿科学分会新生儿学组2003年昆明会议标准[18])；⑤ PLT<50×109·L-1；⑥少尿(<0.5 mL·kg-1·h-1，至少持续24 h)、进行性加重的氮质血症；⑦出现硬肿；⑧家属要求放弃治疗。

1.8 安全性观察指标 于亚低温治疗前、亚低温治疗结束时(生后4 d左右)和EPO疗程结束后(14 d)3个时点采集外周静脉血用于实验室指标的检测；全身亚低温治疗期间记录尿量。

1.8.1 rh-EPO相关不良事件[14]治疗前和治疗后14 d Hb、RBC、Hct和PLT。

1.9 统计学分析 采用SPSS 16.0软件进行统计分析。两组计量资料比较采用t检验，两组不良事件的发生率比较采用χ2检验。检验水准双侧α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 亚低温联合EPO治疗足月儿HIE的临床试验尚在进行之中，本文以2012年2月1日(试验起始)至2015年3月15日满足本文纳入标准的44例中、重度足月儿HIE为观察对象(均为外院转运患儿)，无排除病例。进入本文安全性观察实验组25例(中度HIE 16例，重度HIE 9例)，对照组19例(中度HIE 11例，重度HIE 8例)。两组在性别、出生体重、Apgar评分、惊厥发生率和机械通气比例差异均无统计学意义(表1)。

2.2 治疗期间放弃治疗事件 在亚低温治疗期间对照组1例(重度HIE)因严重贫血停止亚低温治疗，家属要求出院；实验组1例(重度HIE)家属要求停止亚低温治疗，家属对预后悲观要求出院，1例(重度HIE)因持续肺动脉高压难以纠正，停止亚低温治疗，后因多脏器功能衰竭而死亡。

2.3 EPO相关不良事件 表2显示，Hb、RBC、Hct和PLT指标实验组和对照组治疗前和治疗后差异均无统计学意义；实验组RBC在治疗前为(4.9±0.9)×1012·L-1，治疗后为(5.2±0.8)×1012·L-1，P=0.033，余3项指标差异均无统计学意义；对照组在治疗前后的各项指标差异均无统计学意义。

2.4 HIE并发症及其治疗的不良事件 两组患儿均未发生严重不良事件， 均未观察到体温控制困难和皮肤损害，其他一般不良事件发生率实验组与对照组差异均无统计学意义(表3)。

VariableTrialgroup(n=25)Controlgroup(n=19)PM/F(n/n)12/139/100.967GA/weeks39.7±1.639.1±1.30.216BW/g3357±3493256±3980.375Apgarscore 1min2.99±2.032.74±1.520.801 5min5.34±2.135.50±1.670.792 10min6.47±2.146.95±1.390.404Seizure13(52.0)13(68.4)0.272Ventilation14(56.0)10(52.6)0.824

Notes GA:gestational age; BW: birth weight

=

GroupsBeforetreatment(n=44)Hb/g·L-1RBC/×1012·L-1Hct/%PLT/×109·L-1Aftertreatment(n=41)Hb/g·L-1RBC/×1012·L-1Hct/%PLT/×109·L-1Trial173±304.9±0.850.8±8.5218±68184±305.2±0.852±8.8242±102Control172±504.7±1.448.9±12.5236±112172±434.8±1.249.1±11.5204±109P0.9950.5320.5430.5340.2940.150.3780.274

表3 实验组和对照组并发症及其治疗的不良事件[n(%)]

Tab 3 Complications and adverse effects of therapy in trial and control groups[n(%)]

AdversedrugreactionTrial(n=25)Control(n=19)PHypotension7(28.0)1(5.3)0.059Disturbanceofbloodcoagulation7(28.0)5(26.3)0.566Renaldysfunction1(4.0)2(10.5)0.407Hyponatremia2(8.0)3(15.8)0.593Hypokalemia2(8.0)3(15.8)0.381Thrombocytopenia2(8.0)2(10.5)0.598Liverenzymesabnormal2(8.0)4(21.1)0.220Respiratorydistress9(36.0)9(47.4)0.352Sepsisorbacteremia2(8.0)0(0)0.309Polycythemia8(32.0)5(26.3)0.447Hypoglycemia1(4.0)3(15.8)0.216Hypocalcemia5(20.0)2(10.5)0.321Intracranialhemorrhage2(8.0)0(0)0.309Hyperbilirubinemia1(4.0)3(15.8)0.216

3 讨论

EPO是一种蛋白质类激素，主要对于红细胞生成具有选择性促进作用。目前认为EPO主要由肾脏邻球旁器的颗粒细胞产生。目前，EPO主要用于治疗成人的心血管系统疾病[24]，如各种类型的贫血、慢性心力衰竭和心肌梗死等，也有研究表明EPO在糖尿病[25]和帕金森病[26]中有良好的应用前景。近年研究发现，EPO和EPO受体(EPOR)也存在于大脑皮质、小脑、海马、腺垂体和脊髓中，缺氧可以诱导EPO在中枢神经系统产生，且内源性的EPO具有嗜神经活性和促血管生成的特点，具有脑保护作用，特别在新生儿时期，同时具有促进脑发育和成熟的作用。动物实验表明，静脉注射一定浓度的EPO可以透过血脑屏障[27]，与其受体结合激活多种细胞内信号通路，抑制细胞凋亡并使缺氧区神经元密度和神经突触数目增加，最终促进缺氧/缺血大脑的蛋白质合成、血管增生和神经轴突修复，减少继发性IL-1β的生成和白细胞在中枢神经系统的渗透，对缺氧和酸中毒大脑起到减轻脑损伤程度、降低对学习能力的损害，并可改善远期空间记忆功能等神经保护作用[6,7,28～31]，在HIE的治疗中有着良好的开发前景。有RCT显示，重复、低剂量rh-EPO治疗中度HIE可降低18月龄时伤残的风险，且无明显不良事件[14]。

亚低温联合EPO治疗HIE的动物实验表明，亚低温联合EPO治疗围生期缺氧缺血性脑损伤较单用亚低温或EPO有临界的增效作用，但在改善组织学上的脑损伤范围和白质损伤程度方面较单用亚低温治疗差异无统计学意义[8, 10]。尽管动物实验中没有明确阐明联合治疗的增效作用，但是也没有发现联合治疗带来不利影响。 一项Ⅰ期小样本(n=24)研究对中、重度HIE亚低温治疗患儿静脉注射不同剂量EPO，结果表明尽管EPO呈现非线性药动学特征，但是在2 500 U·kg-1使用EPO患儿中没有过量积累[32]。动物实验表明，EPO 1 000 U·kg-1静脉注射联合亚低温治疗的耐受性良好并且产生神经保护作用的血药浓度[12]。

目前，成人中暂没有低温条件下使用EPO的报道；而国内外关于低温下使用EPO治疗新生儿HIE的研究多数将研究重点放在两者联合使用的疗效分析上，而安全性研究甚少。EPO具有促进红细胞生成、促进血小板生成、增强血小板活性和激活内皮细胞的特点[13]，可能导致红细胞增多症、血小板一过性增高、短暂促血栓形成等不良事件[33]。有临床研究显示亚低温联合EPO治疗组与单用亚低温治疗组在治疗前后的Hb、RBC、Hct、Ret(网织红细胞)和PLT水平差异无统计学意义[14]，与本研究结果一致，而本研究还分别比较了实验组和对照组在治疗前后的各项指标的差异，表明实验组在治疗后RBC明显增高，但增高程度与对照组差异无统计学意义，说明亚低温条件下使用EPO可促进红细胞的生成，但与单用亚低温相比并不增加此不良事件的发生。美国加利福尼亚大学相关研究[12]结果显示，亚低温联合EPO不增加严重不良事件的发生率，亦不增加HIE并发症的发生率，与本文相关结果一致。

EPO的神经保护作用为新生儿HIE的治疗提供了更为开阔的领域，但也有研究认为，EPO可能会对正常的神经组织产生有害的影响，首先，EPO及其受体产生于大脑发育阶段，在此期间外源性使用EPO可能抑制内源性EPO的产生及其受体的表达；其次，EPO可诱导神经元干细胞增殖，这可能对多能干细胞的正常增殖和分化产生不良影响；最后，EPO可抑制细胞凋亡，会干扰正常的大脑发育过程中的某些环节[34]。因此，还需要进一步随访研究对象远期的神经发育结局，对亚低温联合EPO的神经保护作用进行更为具体的评价。

本研究为随机、单盲、安慰剂对照的多中心研究，观察亚低温联合EPO治疗中、重度足月儿HIE的疗效，本文为上述研究的安全性观察部分。本研究结果显示，亚低温联合EPO相较于单用亚低温治疗HIE不增加EPO相关不良事件、HIE并发症及亚低温治疗不良事件的发生率，是安全可行的，有待扩大样本量进一步呈现其安全性。

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(本文编辑：张崇凡)

Safety observation of therapeutic hypothermia conjunction with erythropoietin injection in the treatment of term-neonatal hypoxic ischemic encephalopathy

LINBi-yun1,2,GUQiu-fang1,2,ZHANGPeng1,CHENGGuo-qiang1,SHAOXiao-mei1,WANGLai-shuan1,ZHOUWen-hao1
(1DepartmentofNeonatology,Children′sHospitalofFudanUniversity,Shanghai201102,China; 2Co-firstauthor)

WANG Lai-shuan，E-mail:laishuanwang@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the safety of therapeutic hypothermia (TH) conjunction with erythropoietin injection in the treatment of moderate to severe hypoxic ischemic encephalopathy (HIE) in term neonates and to lay the foundation for the multi-center study of the efficacy of combination therapy.MethodsTerm neonates who were admitted to NICU of Children′s Hospital of Fudan University from February 2012 to March 2015 and met the TH treatment criteria were included and grouped by randomization after signing the informed consent. The trial group received TH treatment (72 h) combined with EPO (1 000 U·kg-1, ivgtt. QOD×14 d); and the control group received TH treatment (72 h) and placebo (saline) with the same dosage and usage as EPO. Vital signs, homological and biochemical index, serious adverse events (severe arrhythmia, major vein thrombosis，refractory hypotension and death) and HIE complications of the treatments were recorded and analyzed between two groups.ResultsForty-four term neonates with HIE were admitted for TH treatment with 25 patients received added EPO and the rest received placebo. No statistical significance in the levels of hemoglobin, red blood cells, hematocrit and platelet between the two groups was observed. There was no statistical significance in the serious adverse events and HIE complications either.ConclusionSerious adverse events related to the treatment were not found with the treatment of TH conjunction with EPO for HIE. It is safe and feasible to start a multi-center study on the efficacy of TH combined with EPO in HIE treatment.

Hypoxic ischemic encephalopathy; Newborn; Therapeutic hypothermia; Erythropoietin; Safety

1 复旦大学附属儿科医院新生儿科 上海，201102；2 共同第一作者

王来栓 ，E-mail:laishuanwang@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-5501.2015.02.002

2015-03-03

2015-04-02)