双水相法萃取分离猪胰α-淀粉酶体系的初步研究

刘 英，向 迪，倪浩翔，赵丰丽，2*

（1.广西师范大学 生命科学学院，广西 桂林 541004；2.珍稀濒危动植物生态与环境保护教育部重点实验室，广西 桂林 541004）

猪胰α-淀粉酶（pig pancreaticα-amylase）是由猪胰腺分泌的一种能够水解α-1,4-糖苷键的酶，目前广泛应用于纺织业、畜牧业、制药工业等。但是，目前市场上的α-淀粉酶的主要来自于国外进口的微生物发酵产品，其制备成本较高，提取条件相对复杂，并且α-淀粉酶得率很低[1]。猪胰脏作为α-淀粉酶的提取原料来源充足，而且猪胰α-淀粉酶与人胰α-淀粉酶更为接近，两者的分子质量均为46 ku，最适pH值均为6.7～7.0[2]。在药物机理研究或某些治疗性药物研发中，猪胰α-淀粉酶相对于微生物来源的α-淀粉酶具有更强的优势[3]。另外，由于猪胰脏口感不佳，不受大众喜欢，很多屠宰场是直接丢弃的。猪胰脏作为胰α-淀粉酶的制备原料，价格低廉，生产成本低。

双水相萃取（aqueous two-phase extraction，ATPE）技术是一种分离纯化某些生物大分子的有效方法。在蛋白质、酶、核酸等生物大分子的分离纯化等方面应用广泛，是一种有很大发展潜力的易于工业化应用的生物分离技术[4]。双水相系统通常是由水溶性的两种聚合物组成的或者是一种盐与一种水溶性聚合物组成的体系[5]。与传统的分离纯化技术相比，双水相萃取技术分离纯化蛋白质具有以下优势：萃取环境温和，体系中聚合物对蛋白质的结构有稳定和保护的作用；体系中含水量极高，一般在80%以上，同时聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）和硫酸盐溶液均具有维持生物分子结构稳定的作用，因此蛋白质在双水相体系中不易变性；易于连续操作和生产工艺放大，该系统甚至可直接放大40 000倍；处理容量大，能耗低；不存在有机溶剂残留，PEG是化妆品中的常见成分，对生物分子及人体均无危害[6]。目前已经有多种蛋白质、核酸、病毒和抗生素等通过双水相进行了成功的分离[7-10]。1956年，瑞典科学家ALBERTSSON P A[11]首次采用双水相萃取法分离纯化生物大分子，考察了生物大分子在双水相系统中的分配行为，为双水相萃取技术的发展奠定了坚实的基础。20世纪70年代以后，HUSTEDT H等[12]开始尝试将双水相萃取技术应用于工业生产。1980年以后，国内也开展了相关的研究，杨基础等[13]采用聚乙二醇/磷酸盐双水相体系成功的从枯草杆菌发酵液中提取到α-淀粉酶。郅文波等[14]成功构建了α-淀粉酶的双水相系统纯化模型，为双水相系统的研究提供了理论基础。

本研究以价格低廉、来源广泛的猪胰脏作为制备原料，采用PEG1500/（NH4）2SO4双水相体系对猪胰α-淀粉酶分离条件进行研究，以期为工业提取胰α-淀粉酶提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪胰脏：广西桂林环城北二路屠宰场，广西师范大学生命科学院发酵工程实验室4 ℃保存；PEG400、PEG1500、PEG4000：锦山化工有限公司；硫酸铵[（NH4）2SO4]：广州市德松化工有限公司；甲醛、硫酸（H2SO4）、氢氧化钠（NaOH）：汕头市西陇化工有限公司；磷酸钠：浙江东越化工有限公司；可溶性淀粉：天津市基准化学试剂有限公司；3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）：广州市榕晟化工有限公司。所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

BS223S型电子天平：北京塞多利斯仪器系统有限公司；HWS-26型恒温水浴锅：上海一恒科技有限公司；UVmini-1240紫外可见分光光度计：日本岛津公司；XL.39-YYQ移液枪：加拿大BBI公司；TDL-80-2B型飞鸽低速台式离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 双水相体系中水分含量的测定[15]

水分含量测定采用烘箱干燥法：双水相体系总液经电子天平测质量后放入烘箱中80 ℃烘干至质量恒定，再次测定其质量。双水相体系的水分含量计算公式如下：

式中：W1为双水相体系的水分含量，%；m1、m2分别为烘干前后双水相体系的质量，g。

1.3.2 硫酸铵含量的测定[16]

硫酸铵含量的测定采用甲醛法：（NH4）2SO4与甲醛作用，生成六次甲基四胺盐N4（CH2）6、H2SO4及水，用NaOH标准溶液滴定H2SO4和N4（CH2）6，通过所消耗的NaOH的体积求得H2SO4和N4（CH2）6的量，可推算出（NH4）2SO4的含量，其计算公式如下：

式中：W2为（NH4）2SO4在两相中的含量，g；V为所消耗的NaOH标准溶液的体积，mL；C为NaOH标准溶液的浓度，1 mol/L。

1.3.3 PEG含量的测定[17]

PEG含量的测定参照参考文献[17]，其计算公式如下：

1.3.4 猪胰α-淀粉酶粗酶液的制备[18]

取解冻后除去杂质的猪胰脏50.0 g，剪碎，加50 mL pH值为7.0的磷酸盐缓冲液，于均质机中常温下2 000 r/min均质5 min，纱布过滤，所得滤液即为α-淀粉酶粗酶液。

1.3.5 猪胰α-淀粉酶酶活力的测定[19]

将0.5 mL粗酶液加入到0.5 mL 1%可溶性淀粉-磷酸钠缓冲液（20 mmol/L，pH 6.9）中，在25 ℃水浴中反应3 min，立即加入1 mL 3,5-二硝基水杨酸（DNS）显色剂显色，用DNS法测定还原糖含量。

酶活力单位定义[20]：在一定条件下，1 min催化产1 μmol还原糖的酶量为一个酶活力单位（U）。

1.3.6 PEG/（NH4）2SO4双水相体系的制备[21]

将不同分子质量的PEG和（NH4）2SO4分别溶于蒸馏水，分别制成质量分数为50%的PEG原溶液和（NH4）2SO4原溶液。准确称取2 mL的PEG原溶液，加入10 mL的刻度试管中，缓慢滴加（NH4）2SO4原溶液，边滴加边振荡混匀，直至试管出现混浊为止，记录已加入（NH4）2SO4原溶液的体积，计算得加入（NH4）2SO4的质量。然后加入0.5 mL的ddH2O，使体系变澄清。重复上述步骤，计算每次体系达到混浊时（NH4）2SO4和PEG在总体系中的质量百分比，以PEG的质量分数为纵坐标，（NH4）2SO4的质量分数为横坐标，得出PEG/（NH4）2SO4双节线图。

固定体系总质量为10 g（其中粗酶液为5 g，一定质量分数的PEG溶液和（NH4）2SO4溶液共5 g）轻微振荡混匀后静置15 min，分相后根据试管上的刻度读出上下相的体积（Vt和Vb），用吸管吸取上相和下相液体各1 mL于10 mL的刻度试管中，测出相比和上下相酶活，相比、胰α-淀粉酶分配系数和萃取率的计算公式如下：[22]

式中：Vt、Vb分别为上下相体积，mL。

胰α-淀粉酶分配系数

式中：Ct、Cb分别为上下相分配物质浓度，mol/L。

式中：R为相比；Ka为胰α-淀粉酶的分配系数；Y为萃取率，%。

1.3.7 （NH4）2SO4质量分数对胰α-淀粉酶分配行为的影响

固定PEG质量分数不变，pH值为7.0，酶液体积5 mL，分别选取质量分数为8%、10%、12%、14%、16%、18%的（NH4）2SO4组成双水相体系，测定酶的分配系数、相比和萃取率。

1.3.8 PEG质量分数对胰α-淀粉酶分配行为的影响

固定（NH4）2SO4质量分数不变，pH值为7.0，酶液体积5 mL，选取不同质量分数的PEG组成双水相体系，测定酶的分配系数、相比和萃取率。

1.3.9 pH值对胰α-淀粉酶分配行为的影响

固定PEG和（NH4）2SO4质量分数均不变，酶液体积5 mL，分别选取pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0组成双水相体系，测定酶的分配系数、相比和萃取率。

1.3.10 双水相法萃取分离猪胰α-淀粉酶体系的正交优化

根据单因素试验结果，优化双水相法萃取分离猪胰α-淀粉酶体系。以酶的分配系数（Ka）和萃取率（Y）为评价指标，选择（NH4）2SO4质量分数、PEG质量分数和pH值等3个因素，进行L9（33）正交试验。

2 结果与分析

2.1 PEG/（NH4）2SO4双水相系统双节线图

双水相的形成条件以及定量关系可采用相图的方式表现出来。根据上下两相中PEG与（NH4）2SO4的质量分数可在PEG/（NH4）2SO4质量分数图中得到几个不同的点，依次连接这些点可得到一条顺滑的曲线，即为PEG/（NH4）2SO4双水相系统双节线图。分别选用PEG400、PEG1500、PEG4000和（NH4）2SO4溶液作为双水相体系支撑物质作双水相系统双节线图，结果见图1。

图1 PEG/（NH4）2SO4双水相系统双节线图Fig.1 Binodal curves of PEG/(NH4)2SO4aqueous two phase system

由于高聚物的不相容性和硫酸盐的盐析作用，一定浓度的PEG与（NH4）2SO4溶液会在水中形成两相。由图1可知，PEG分子质量越大，其双节线的形状就越不对称，这是因为同一类聚合物的疏水性随分子质量的增大而增强[23]，当聚合物的分子质量减小时，蛋白质易分配于富含该聚合物的相。同时VAIDYA B K等[24]认为小分子质量的PEG对蛋白质的选择较差，不适合分离。胰α-淀粉酶主要分配在双水相体系中的上相，由图1可知，PEG4000形成分相所需的PEG质量分数过高，由于高聚物的不相容性，会造成胰α-淀粉酶在上相中的分配率过低。而PEG400由于分子质量过小，会导致核酸及其他杂蛋白在上相的溶解度增加。因此本试验选择PEG1500作为双水相系统的组成成分。

2.2 硫酸铵质量分数对胰α-淀粉酶分配系数和萃取率的影响

研究不同质量分数的硫酸铵对胰α-淀粉酶的分配系数和萃取率的影响，结果见图2。

图2 硫酸铵质量分数对分配系数和萃取率的影响Fig.2 Effects of different concentration of (NH4)2SO4on partition coefficient and extraction rate

由图2可知，固定PEG1500质量分数为20%，同时调节双水相系统pH值为7，在（NH4）2SO4质量分数8%～12%，随着（NH4）2SO4质量分数增加，酶的分配系数也随之增加。当（NH4）2SO4质量分数为12%时，分配系数Ka达到最高值5.33；之后随着（NH4）2SO4质量分数的增加，分配系数又逐渐下降。同时萃取率是随着（（NH4）2SO4质量分数增加而呈总体下降趋势，因此选用分配系数较大时（NH4）2SO4质量分数12%进行后续试验。

此外，由于分配系数均＞1，可见胰α-淀粉酶主要分配在上相[25]。大部分不溶性杂质（结构组织蛋白、脂肪等）主要分配在两相之间，通过离心即可除去。

2.3 PEG1500质量分数对胰α-淀粉酶分配系数和萃取率的影响

图3 PEG1500质量分数对分配系数和萃取率的影响Fig.3 Effects of different concentration of PEG1500 on partition coefficient and extraction rate

在固定（NH4）2SO4质量分数为12%，同时调节双水相系统的pH值为7.0，研究不同质量分数PEG对胰α-淀粉酶的分配系数和萃取率的影响，结果见图3。

由图3可知，随着PEG1500质量分数的增大，酶的分配系数和萃取率均呈增长趋势，当PEG1500质量分数为18%时，分配系数Ka和萃取率Y都达到最大值分别为4.88和66.7%；随着PEG1500质量分数的继续增大，其疏水性越来越高，从而导致胰α-淀粉酶向下相转移，分配系数和萃取率开始呈下降趋势[26]。因此选用质量分数为18%的PEG1500进行后续试验。

2.4 pH值对胰α-淀粉酶分配系数和萃取率的影响

在固定PEG1500质量分数为18%，（NH4）2SO4质量分数为12%时，研究不同pH值对胰α-淀粉酶的分配系数和萃取率的影响，结果见图4。

图4 pH值对分配系数和萃取率的影响Fig.4 Effects of pH on partition coefficient and extraction rate

双水相体系中pH值的变化对于胰α-淀粉酶在两相中的分配行为影响极大，体系的pH值偏离目的蛋白胰α-淀粉酶的等电点太远（pH值过大或过小），均会造成胰淀粉酶活性损失，从而影响酶的分配系数和萃取率。pH值变化可影响双水相系统中的硫酸盐的解离度，从而导致上相跟下相之间的电位差发生改变，最终使得胰α-淀粉酶在双水相体系中的分配行为发生改变[27]。

由图4可知，随着pH值的增大，分配系数和萃取率都呈现先增大后减小的趋势，并且在pH值为7.0时都达到最大值分别为6.01和79.20%。因此，选用pH值为7.0进行后续试验。

2.5 双水相萃取胰α-淀粉酶的正交优化试验

为进一步优化双水相萃取条件，设定（NH4）2SO4质量分数为A，PEG1500质量分数为B，pH值为C，分别以酶的分配系数（Ka）和萃取率（Y）为评价指标进行3因素3水平正交试验，结果见表1和表2。

由表1可知，因素对分配系数和萃取率影响的主次顺序为A＞B＞C，即（NH4）2SO4质量分数＞PEG1500质量分数＞pH值，以分配系数和萃取率为评价指标的最优条件均为A2B2C2，即（NH4）2SO4质量分数为12%，PEG1500质量分数为18%，pH值为7.0。在此最佳条件下对猪胰α-淀粉酶进行双水相萃取验证试验，其分配系数和萃取率分别达到8.48和80.25%，α-淀粉酶活为1 690 U/mL。

表1 萃取条件优化正交试验结果及分析Table 1 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

表2 正交试验结果方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，（NH4）2SO4质量分数对分配系数的影响达到显著水平，对萃取率的影响达到了极显著的水平。PEG1500质量分数对分配系数的影响不显著，但对萃取率的影响达到显著水平。pH值对分配系数和萃取率的影响均不显著。

3 结论

本研究通过正交试验确定双水相体系萃取条件为12%（NH4）2SO4，18%PEG1500，pH值为7.0时，对胰α-淀粉酶的萃取效果最好，其分配系数Ka和萃取率Y分别为8.48和80.25%，α-淀粉酶活为1 690 U/mL。该方法胰α-淀粉酶酶活损失较少，萃取率高，可为胰α-淀粉酶分离纯化提供借鉴。

[1]杨东来，高学军.猪胰淀粉酶的制备工艺研究[J].药物生物技术，2006，13（3）：211-213.

[2]闵玉涛，宋彦显，徐凤才.猪胰脏淀粉酶的提取、部分纯化与性质研究[J].食品工业科技，2011，32（1）：169-172.

[3]BASKIR J N,HATTON T A,SUTER U W.Protein partitioning in two-phase aqueous systems[J].Biotechnol Bioeng,1989,34(6):541-558.

[4]谢蓝华，杜 冰，张嘉怡，等.双水相萃取技术在食品工业中的应用研究进展[J].食品机械，2012，28（5）：234-238.

[5]杨利民，吕金萍，冯 妍.蒲公英总黄酮在聚乙二醇-硫酸铵双水相体系中的分配与提取[J].化工进展，2014，33（8）：1992-1997.

[6]孙亚莉，张喜峰.双水相萃取分离红豆蛋白质[J].中国酿造，2013，32（6）：114-118.

[7]杜学敏，武金霞，张贺迎，等.双水相提取糖化酶的研究[J].中国酿造，2007，26（1）：7-9，49.

[8]孙亚莉，张 瑾，裴淑平.双水相体系分离葡萄籽多糖[J].中国酿造，2013，32（7）：89-93.

[9]ZHI W B,DENG Q Y,SONG J N,et al.One-step purification of α-amylase from the cultivation supernatant of recombinantBacillus subtilisby high-speed counter-current chromatography with aqueous polymer twophase systems[J].J Chromatogr A,2005,1070(1-2):215-219.

[10]LI M,PEEPLES T L.Purification of hyperthermophilic archaeal amylolytic enzyme(MJA1)using thermoseparating aqueous two-phase systems[J].J Chromatogr B,2004,807(1):69-74.

[11]ALBERTSSON P A.Chromatography and partition of cells and cell fragments[J].Nature,1956,177:771-774.

[12]HUSTEDT H,KRONERK H,MENGE U,et al.Protein recovery using aqueous two-phase systems[J].Trends Biotechnol,1985,31(6):139.

[13]杨基础，沈忠耀，汪家鼎.用聚乙二醇/磷酸盐双水相体系从枯草杆菌发酵液中提取α-淀粉酶[J].清华大学学报，1987，27（3）：81-89.

[14]郅文波，顾 铭，宋江楠.PEG-柠檬酸盐双水相体系纯化α-淀粉酶及模型构建[J].生物加工过程，2004，2（1）：47-52.

[15]马松梅，柳明珠.丙烯酸盐与丙烯酰胺共聚制备耐盐性高吸水树脂[J].功能高分子学报，2003，16（4）：502-506.

[16]凌家俭，王 宁，王林涛.高活性α-淀粉酶的分离与纯化[J].苏州大学学报，2009，29（5）：930-932.

[17]李 波，芦 菲，张军合.双水相萃取法分离纯化α-淀粉酶的研究[J].食品工业科技，2006，27（8）：77-79.

[18]魏文毅，张丽萍，王 琴，等.猪胰脏中胰酶的制备新工艺技术研究[J].黑龙江八一农垦大学学报，2011，23（1）：72-78.

[19]陈 波.产酸性α-淀粉酶菌株的筛选及其酶学的性质研究[D].南京：南京工业大学硕士论文，2004.

[20]曾东方，杨 帆，聂欢欢.DNS 法对食用菌发酵液淀粉酶活力的测定[J].现代农业科技，2011，40（11）：16-18.

[21]李 勃，党 永，马 瑜，等.耐酸性α-淀粉酶的分离纯化提取及性质研究[J].西北大学学报，2008，38（3）：435-438.

[22]涂绍勇，李 路，杨爱华，等.双水相萃取法提取木瓜蛋白酶的研究[J].食品工业科技，2010，32（9）：220-222.

[23]曹军卫，马辉文.微生物工程[M].北京：科学出版社，2002.

[24]VAIDYA B K,SUTHAR H K,KASTURE S,et al.Purification of potato polyphenol oxidase (PPO)by partitioning in aqueous two-phase system[J].Biochem Eng J,2006,28(2):161-166.

[25]房耀维，刘 姝，吕明生.双水相萃取法分离低温α-淀粉酶的研究[J].食品科学，2009，30（18）：159-162.

[26]董海莉，平文祥，葛菁萍.双水相法萃取分离α-淀粉酶体系的初步研究[J].黑龙江大学学报，2011，28（3）：378-382.

[27]周红航，王维香.聚乙二醇/硫酸铵双水相体系萃取猪胰蛋白酶[J].化工进展，2009，28（2）：305-309.