长链烷烃降解菌C6的鉴定及性能研究

吕立君，王光华，李文兵，卢露露，刘念汝，陈 彪

（武汉科技大学 化学工程与技术学院，湖北 武汉 430081）

长链烷烃降解菌C6的鉴定及性能研究

吕立君，王光华，李文兵，卢露露，刘念汝，陈 彪

（武汉科技大学 化学工程与技术学院，湖北 武汉 430081）

从含油活性污泥中筛选出一株长链烷烃降解菌C6，进行了菌种鉴定，考察了该菌对正十六烷及柴油和石蜡的混合物的降解能力，并对由菌株C6产生的生物表面活性剂进行了鉴定。实验结果表明：该菌为鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）；对液体培养基中质量浓度为1 000 mg/L的正十六烷降解48 h后，降解率接近100%，降解动力学曲线的拟合结果符合Monod模型；对液体培养基中质量浓度为1 000 mg/L的柴油和石蜡的混合物降解96 h后，降解率达93%；菌株C6产生的生物表面活性剂经FTIR分析鉴定为磷脂类表面活性剂，排油圈直径为60 mm，临界胶束质量浓度约为25 mg/L，可将水的表面张力降至27.09 mN/m。

长链烷烃；含油活性污泥；菌种筛选；生理生化鉴定；降解动力学；生物表面活性剂

长链烷烃是严重破坏生态环境的有机污染物之一，由于其化学性质稳定、疏水性强、常温常压下为固体，很难自然降解，易对环境造成长期的危害。经污水厂处理后的石化废水仍含有大量的长链烷烃，作为循环水使用时可将长链烷烃带入新一轮的生产中。刘雪琴［1］采用生物活性炭技术处理武钢焦化厂二沉池废水，反应后仍有部分长链烷烃未被彻底降解。对武钢焦化厂蒸氨塔原水及引用的中水采用气相色谱-质谱联用技术进行定性分析，发现长链烷烃均来自中水。通过针对未降解的长链烷烃持续筛菌，完善复合菌系，可达到更好的生化处理效果。由于长链烷烃的疏水性，需筛选出一株能产生表面活性剂的菌株，以降低长链烷烃与水的表面张力。生物表面活性剂除了具有良好的降低表面张力、乳化、发泡的特性外，还具有易生物降解、无污染的优点［2］。不同的菌株产生不同的生物表面活性剂。根据亲水基的不同，表面活性剂可分为糖脂类，脂肽类，磷脂类，脂肪酸类，结合多糖、蛋白质和脂的聚合物等5类［3］。

本工作从含油活性污泥中筛选出一株能产生表面活性剂的长链烷烃降解菌，对其进行了菌种鉴定，研究该菌对正十六烷及柴油和石蜡的混合物（简称柴蜡混合物）的降解能力，并对由该菌株产生的生物表面活性剂进行鉴定与性能研究。

1 实验部分

1.1 试剂、材料和仪器

正十六烷：色谱纯；柴油、石蜡：分析纯。含油活性污泥：取自中国石化武汉石油（集团）股份有限公司曝气池。

LB培养基：酵母浸提物5 g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 L。pH为6.8～7.2，于121.3 ℃下湿热灭菌20 min后备用。

无机盐培养基：硝酸铵1 g，磷酸氢二钠1.42 g，磷酸二氢钾1.36 g，七水硫酸镁0.432 g，氯化钙0.006 g，微量元素混合液1 mL，蒸馏水1 L。pH为6.8～7.2，于121.3 ℃下湿热灭菌20 min后备用。其中，微量元素混合液成分为一水硫酸锰1.69 g/L，六水氯化钴0.24 g/L，硼酸1.16 g/L，二水钼酸钠0.024 g/L，七水硫酸亚铁2.78 g/L，七水硫酸锌1.15 g/L，五水硫酸铜0.38 g/L。

在上述培养基中分别加入质量分数为2%的琼脂，得到相应的固体培养基。

Agilent 6890型气相色谱仪：德国安捷伦有限公司；UV-2000型紫外-可见分光光度计：上海美普达仪器有限公司；JK99型全自动张力仪：上海忠臣数字设备技术有限公司；Mastercycler gradient VERTEX 70型傅里叶变换红外光谱仪：德国Bruker有限公司。

1.2 长链烷烃降解菌的筛选及鉴定

向采集到的含油活性污泥中加入一定量的蒸馏水，离心10 min，取适量上清液接种于以正十六烷（质量浓度为500 mg/L）为唯一碳源的100 mL LB液体培养基中，于温度35 ℃、转速125 r/min的恒温摇床中培养36 h。取4 mL菌液接种于以正十六烷（质量浓度为500 mg/L）为唯一碳源的100 mL无机盐培养基中，于温度35 ℃、转速125 r/min的恒温摇床中培养一段时间，反复操作，使正十六烷质量浓度从500 mg/L逐步提高至5 000 mg/L。取适量富集培养液，稀释后均匀涂布在LB固体培养基平板上。待有明显菌落出现后，采用平板划线分离法分离单菌落。

挑取单一菌落接种于正十六烷质量浓度为1 000 mg/L的无机盐培养基中，于温度35 ℃、转速125 r/min的摇床中振荡48 h。采用气相色谱仪检测剩余正十六烷的质量浓度，选出降解率最高的菌株C6。

按照文献［4］报道的方法对菌株C6进行16S rDNA分子遗传学鉴定。

1.3 长链烷烃降解菌对正十六烷和柴蜡混合物的降解

将优势菌C6按4%（φ）的接种量接种于正十六烷质量浓度为1 000 mg/L的无机盐培养基中，于温度35 ℃、转速125 r/min的恒温摇床中培养，定时取样，测定菌体生长曲线和正十六烷质量浓度。

在相同实验条件下，采用菌株C6降解质量浓度为1 000 mg/L的柴蜡混合物。

1.4 表面活性剂的提取

按照文献［5］报道的方法，从接种菌株的正十六烷无机盐培养基中提取表面活性剂并纯化。

1.5 分析方法

以菌体培养液在600 nm处的吸光度（OD600）表征培养液中的菌体浓度。

采用气相色谱仪测定正十六烷的质量浓度。色谱条件：进样口温度300 ℃，检测器温度300℃，柱温150 ℃保持1 min，以10 ℃/min的升温速率梯度升温至280 ℃，进样量1 μL。

采用全自动张力仪测定表面张力。

采用紫外分光光度法［6］，在225 nm处测定柴蜡混合物的吸光度，计算柴蜡混合物的质量浓度。

按照文献［7-8］报道的方法测定生物表面活性剂的排油活性、乳化性和临界胶束质量浓度。按照文献［9］报道的方法对生物表面活性剂进行FTIR分析。采用薄层层析法对生物表面活性剂进行薄层分离，根据不同显色剂的显色结果判断生物表面活性剂的种类［9］。

2 结果与讨论

2.1 长链烷烃降解菌的16S rDNA鉴定

通过提取菌株C6的基因组DNA，将筛选出的PCR产物送武汉擎科有限公司测序。测序后获得总长为1 414 bp的16S rDNA基因片段，该序列在GenBank中的登陆号为KR072555。

菌株C6的16S rDNA序列与不动杆菌属（Acinetobacter sp.）的16S rDNA序列相近，同源性大于98%。因此，初步鉴定菌株C6为不动杆菌属（Acinetobacter sp.）。

将菌株C6的16S rDNA序列与GenBank中相关序列进行BLAST相似性分析，对同源性高的11株菌株用Mega软件以相近序列构建系统发育树。菌株C6与Acinetobacter baumannii IBL-4C6处于同一支。因此，鉴定菌株C6为鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）。

2.2 菌株C6对正十六烷的降解

正十六烷的降解曲线和菌株C6的生长曲线见图1，正十六烷无机盐培养基的表面张力见图2。

图1 正十六烷的降解曲线和菌株C6的生长曲线● 正十六烷质量浓度；■ OD600

图2 正十六烷无机盐培养基的表面张力

由图1和图2可见：菌株C6的生长趋势与正十六烷的降解过程基本同步，表明菌株C6能以正十六烷作为唯一碳源促进自身生长，并对正十六烷进行降解；降解时间为0～12 h时，OD600较低，主要是因为正十六烷不溶于水，在降解初期，细胞与底物之间的接触受限，妨碍了底物的代谢速率，导致菌体生长速率缓慢；降解12～36 h时，OD600迅速增加，正十六烷质量浓度逐渐降低，在此阶段菌株C6分泌出生物表面活性剂，该表面活性剂对正十六烷具有增溶作用，将正十六烷无机盐培养基的表面张力降至27 mN/m左右；降解36 h后，菌株C6的生长进入稳定期；降解48 h后，正十六烷基本降解完全，降解率接近100%，菌株C6因缺少碳源而进入衰亡期。

2.3 菌株C6降解正十六烷的动力学方程

采用Monod方程建立菌株C6对正十六烷的降解模型［10-11］。Monod方程表明了底物浓度和降解速率的定量关系，见式（1）。

式中：v和vmax分别为底物生物降解速率和最大底物生物降解速率，mg/（L·h）；K为底物半饱和系数，mg/L；ρ为底物质量浓度，mg/L。

以1/ρ为横坐标，1/v为纵坐标，得到1/v～1/ρ的关系曲线，见图3。1/v～1/ρ的关系曲线方程为y=5.35x+0.013 5，相关系数为0.998。由图3求得截距1/vmax=0.013 5，得出vmax=74.1 mg/（L·h）；斜率K/vmax=5.35，可得K=396.3 mg/L。由此可见，得到菌株C6降解正十六烷的动力学方程为v=74.1ρ/（396.3+ρ）。

图3 1/v～1/ρ的关系曲线

2.4 菌株C6对柴蜡混合物的降解

柴蜡混合物的降解曲线见图4。由图4可见：降解时间为0～36 h时，降解速率较快，柴蜡混合物质量浓度由1 000 mg/L降至500 mg/L以下，柴蜡混合物中短链烷烃基本降解完全；降解时间为36～96 h时，降解速率下降，推测可能是由于烷烃碳链长度的增加，降解难度增大；经过96 h的降解，柴蜡混合物降解率达93%，比马秋莎等［12］报道的柴蜡混合物降解率高6%。表明菌株C6对废水中长链烷烃的降解有很高的应用价值，达到了筛菌目的。

2.5 生物表面活性剂的性能分析

由正十六烷无机盐培养基中提取到的生物表面活性剂呈淡黄色粉状，排油圈直径为60 mm，临界胶束质量浓度约为25 mg/L，可将水的表面张力降至27.09 mN/m。

生物表面活性剂的FTIR谱图见图5。由图5可见，3 442 cm-1处出现了O—H键的吸收峰，1 644 cm-1处出现了NH+的吸收峰，1 531 cm-1和1 398 cm-1处出现了C=O键的吸收峰，1 107 cm-1处出现了PO—R键的吸收峰，667 cm-1处出现了P=S键的吸收峰。结合Robert等［13］的研究结果和薄层层析法的鉴定结果，判定菌株C6产生的表面活性剂为磷脂类表面活性剂。

图4 柴蜡混合物的降解曲线● 柴蜡混合物质量浓度；■ 柴蜡混合物降解率

图5 生物表面活性剂的FTIR谱图

3 结论

a）从含油活性污泥中筛选出一株长链烷烃高效降解菌C6。经鉴定该菌为鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）。

b）菌株C6对液体培养基中质量浓度为1 000 mg/L的正十六烷降解48 h后，降解率接近100%，降解动力学符合Monod模型。

c）菌株C6对液体培养基中质量浓度为1 000 mg/L的柴蜡混合物降解96 h后，降解率达93%。说明菌株C6对长链烷烃有良好的降解作用。

d）菌株C6产生的生物表面活性剂经鉴定为磷脂类表面活性剂，排油圈直径为60 mm，临界胶束质量浓度约为25 mg/L，能将水的表面张力降至27.09 mN/m。

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（编辑 王 馨）

Identification and Characteristics of Long-Chain Alkane Degrading Strain C6

Lü Lijun，Wang Guanghua，Li Wenbing，Lu Lulu，Liu Nianru，Chen Biao
（College of Chemical Engineering and Technology，Wuhan University of Science and Technology，Wuhan Hubei 430081，China）

The long-chain alkane degrading strain C6 from oily activated sludge was identified. Its degradation abilities to n-hexadecane and the mixture of diesel and paraffin were studied，and the bio-surfactant produced by it was characterized. The experimental results show that：Strain C6 is Acinetobacter baumannii；After n-hexadecane with 1 000 mg/L of mass concentration in medium is degraded for 48 h，the degradation rate is nearly 100%，and the degradation kinetic curve meets the Monod model；After the diesel and paraff i n mixture with 1 000 mg/L of mass concentration in medium is degraded for 96 h，the degradation rate is 93%；The bio-surfactant produced by strain C6 is characterized by FTIR and identif i ed as phospholipids with 60 mm of oil spreading size，25 mg/L of critical micelle mass concentration （CMC）and the water surface tension is decreased to 27.09 mN/m by it.

long-chain alkane；oily activated sludge；strain screening；physiological and biochemical identif i cation；degradation kinetics；bio-surfactant

X172

A

1006-1878（2015）05-0487-05

2015 - 05 - 23；

2015 - 06 - 29。

吕立君（1990—），女，湖北省武汉市人，硕士生，电话 15926487793，电邮 927712226@qq.com。