铜锈环棱螺室内实验条件优化

范强，陶秉春，王博，张责研，曾瑞，安立会,*

1. 天津农学院，天津 300384 2. 中国环境科学研究院，北京 100012



铜锈环棱螺室内实验条件优化

范强1,2，陶秉春1，王博2，张责研2，曾瑞2，安立会2,*

1. 天津农学院，天津 300384 2. 中国环境科学研究院，北京 100012

铜锈环棱螺作为一种新兴的潜在生态毒理学模式生物，适宜实验条件是开展其室内毒理学研究的基础。在人为控制条件下，初步探讨了饵料、水深、底质、密度和钙离子浓度养殖条件对铜锈环棱螺成体生长的影响，并进一步对麻醉条件进行了筛选(MgCl2·2H2O、乙醇、丁香酚、盐酸普鲁卡因和MS-222)。结果表明：当投喂冰鲜小球藻、密度6 个·L-1水体积、水深10～15 cm、泥土底质并且水中钙离子浓度30 mg·L-1时，铜锈环棱螺的体重增长最为明显。麻醉效果表明，MgCl2·2H2O对成螺的麻醉时间短并且伤害小，可作为实验用麻醉剂首选。以上研究结果为发展以铜锈环棱螺为模式生物开展环境(生态)毒理学研究奠定了基础。

铜锈环棱螺；模式生物；养殖条件；麻醉剂；优化

当前，随着环境(生态)毒理学的快速发展和科学需求，无脊椎软体动物作为一种新兴模式生物得到了前所未有的关注，并在水质安全、沉积物质量以及危险化学品毒性评估等研究中得到了应用[1-2]。研究发现，软体动物对污染物暴露表现出比脊椎动物(如鱼类)更为敏感的特征，如淡水泥螺(Potamopyrgus antipodarum)比虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、鲤鱼(Cyprinus carpio)和黑头呆鱼(Pimaphales promelas)等脊椎动物对内分泌干扰物(如雌激素)以及污水处理厂出水产生更为明显的内分泌干扰效应[3]，而河蚌(fatmucket, Lampsilis siliquoidea)对水环境中铜和氨氮表现出比现有标准生物更高的灵敏度[4]，促使美国EPA对淡水水质指标中的氨氮标准做了修订[5]。

铜锈环棱螺(Bellamya aeruginosa)，属软体动物门(mollusca)、腹足纲(gastropoda)、田螺科(viviparidae)，广泛分布于我国的河流和湖泊中，在水生态系统食物网的物质循环和能量流动中发挥着极其重要的作用[6]。同时，铜锈环棱螺为雌雄异体，卵胎生，易于饲养、个体规格适中、生长快、繁殖能力强，可作为一种潜在的淡水无脊椎模式生物开展生态毒理学研究[7]。近年，国内以铜锈环棱螺作为实验生物开展的毒理学研究逐渐增多[8-12]，这就要求能够连续供应高质量的实验生物，从而也对生物的室内养殖条件提出了较高要求。然而，与斑马鱼和爪蟾等其它模式生物已有的室内养殖规范和条件相比[13-14]，目前铜锈环棱螺室内养殖并没有成熟的养殖体系，不同实验室根据自身条件来养殖所需的实验生物，这就造成不同实验室之间所取得的科学数据不具有可比性，从而严重限制了以铜锈环棱螺作为模式生物的科学发展。

本文以体重增长率为评判终点，分别从饵料、水深、底质、密度和钙离子角度方面对铜锈环棱螺的室内养殖条件进行了优化，并对不同麻醉剂的麻醉效果进行了比较，研究结果为以铜锈环棱螺为模式生物开展生态毒理学研究奠定了基础。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

实验用铜锈环棱螺(体重：1.72±0.48 g；壳高：29.4±2.4 mm)采于全国水产引育种中心(北京)池塘。将捕捞的实验螺置于实验室内暂养3～5 d(24±0.5 ℃)，根据触角的第二性特征区分雌雄(雌螺：左右两只触角等长并且直；雄螺：左侧触角弯曲并特化成雄性交接器(腹面观))，每天投喂新鲜微绿球藻并更换部分充分曝气的自来水，同时连续充气以保证溶解氧水平。

1.2 室内养殖因子优化

随机挑选活力强的实验螺放入实验缸，每组设置3个平行。实验缸为一次成型玻璃缸(30×20×30 cm)，实验用水为活性炭过滤并充分曝气的自来水(钙离子优化实验用水为去离子水)。在实验前24 h注水备用，同时每个缸进行连续充气以保证溶解氧水平。所有养殖因子优化条件均为水温24±0.5 ℃，光周期为8(白):16(暗)。

实验前和实验2周后称量每只螺体重，计算体重增长率。另外，在实验结束后解剖实验螺，计数子宫内胚胎数量(分为有壳胚胎和无壳胚胎)。

1.2.1 饵料

将挑选的实验螺随机分组(10 只·组-1)，并分别以鱼薄片饵料(粗蛋白：>40%；粗脂肪：>2.5%：粗纤维：(2～5)%；钙：(0.9～2.0)%；磷：(0.8～1.4)%)(北京三元饲料)、淡水小球藻(C. vulgaris)(大连海洋大学水生生物实验室提供)、鸡蛋黄、玉米面和莴苣叶(市场购买)为实验饵料，投喂量均为0.5 g·次-1，每天2次。实验期间，每天换水1次，每次半量换水。其它条件同上。

1.2.2 水深

将挑选的实验螺随机分组(10 只·组-1)，分别设置水深为5 cm、10 cm、15 cm和20 cm。每天投喂新鲜小球藻2次(0.5 g·次-1)，并换水1次，每次半量换水。其它条件同上。

1.2.3 底质

将挑选的实验螺随机分组(10 只·组-1)，分别以细沙、细土、碎石块、玻璃(缸)作为底质进行比选。其中，细沙和细土使用前用前需过筛去除较大颗粒和其它杂质，并彻底风干后使用；碎石在高锰酸钾溶液(0.1%)浸泡24 h并充分清洗后使用。铺设时基质厚5 cm，上面覆水10 cm。实验期间，每天投喂新鲜小球藻2次(0.5 g·次-1)，每周换水1次，并更换基质1次。其它条件同上。

1.2.4 密度

将挑选的实验螺以10 个·组-1、20 个·组-1、30 个·组-1、40 个·组-1和60 个·组-1进行随机分组。每天投喂新鲜小球藻2次，分别为0.5 g·次-1、1.0 g·次-1、1.5 g·次-1、2.0 g·次-1、3.0 g·次-1。实验期间每天换水1次，每次半量换水。其它条件同上。

1.2.5 钙离子(Ca2+)

将挑选的实验螺随机分组(10 只·组-1)，实验用水用去离子水配置：123.3 mg·L-1MgSO4·7H2O, 63.0 mg·L-1NaHCO3, 5.5 mg·L-1KCl。钙离子浓度(CaCl2·2H2O)分别为0，10，30，100，300，500 mg·L-1。实验期间每天换水1次，每次半量换水。其它条件同上。

1.3 麻醉剂效果比较

麻醉是开展生物毒理学的必要手段，良好的麻醉效果是取得满意结果的基本前提。因此，本文以5种常见麻醉剂为研究对象，初步筛选和比较了不同麻醉剂的麻醉效果,以期为今后开展相关研究奠定基础。具体来讲，实验以MgCl2·2H2O(MgCl2)、丁香酚、酒精、盐酸普鲁卡因、间氨基苯甲酸乙酯甲烷磺酸盐(MS-222)5种麻醉剂作为筛选药品，其中MgCl2浓度设定为0、0.5、1、5、10和20 g·L-1，MS-222为0、5、10、30、100和300 mg·L-1，95%酒精浓度为0、0.5、1、3、5和10%(体积比)，丁香酚浓度为0、0.5、1、3、5、10 mg·L-1；盐酸普鲁卡因浓度为0、5、10、30、100和300 mg·L-1。

将挑选的实验螺随机分组(10 只·组-1)放入结晶皿中(Ø=18 cm)，加入1 L经活性炭过滤并充分曝气的自来水(24±0.5)℃，利用蠕动泵滴加麻醉剂至设置的终浓度(约2 h)，期间每隔10 min观察1次。观察时，用针头轻轻刺激螺的腹足，若没有反应或反应不灵敏，则判定螺处于麻醉状态，记录麻醉所需时间。2.5 h后，将处于麻醉状态的螺移至清水中继续观察，每30 min观察1次，观察方法同上，记录恢复螺数目与恢复时间。根据预实验结果，6.5 h后若有螺仍处于麻醉状态(刺激没有反应)，则认为螺死亡。

1.4 数据分析

各组所得数据以平均值±标准偏差(Mean±S.D)表示。对所得各组数据利用Origin 9.0软件包的进行单因素方差分析(One-way ANOVA)检验各养殖条件的差异性，当P<0.05时用Turkey进行多重比较以检验实验组间的差异性。对各组麻醉率采用非参数检验麻醉效果之间的差异性(SPSS 13.0)。

2 结果与讨论(Results and Discussion)

2.1 饵料优化

从图1可以看出，投喂鱼饵料组实验螺体重增长率为(7.20±2.08)%，而其它各组的增长率相近(1.92%～2.89 %)，各组之间差异不显著(P>0.05)。

图1 饵料对螺体重增长的影响Fig. 1 Bellamya aeruginosa body growth feeding with different foods

需要指出的是，鱼饵料与小球藻投喂组实验螺体重增长率的标准偏差较小，而莴苣叶、鸡蛋黄与玉米面组的偏差较大，说明鱼饵料和小球藻投喂的效果最好，可作为室内养殖螺的首选饵料，尤其是鱼饵料是人工配合饵料，含有生物生长发育所需的各种营养元素包括粗蛋白、粗脂肪以及钙和磷等元素。Eveland等[15]也发现投喂混合饵料的螺个体和繁殖能力均得到提高。然而，人工配合饵料中可能会含有一些促生长剂和增色剂等添加物，这对一些特定实验目的研究如揭示化学品的内分泌干扰效应就可能产生干扰，而小球藻作为天然产物(浮游植物)可作为首选饵料。

另外，从繁殖力(胚胎数量)来看，投喂不同饵料之间没有显著性差异(P>0.05)。然而，投喂小球藻和莴苣叶的实验螺怀有的胚胎中，有壳胚胎数量多于无壳胚胎，而投喂其它饵料(鱼饵料、鸡蛋黄和玉米面)实验螺怀有的无壳胚胎多于有壳胚胎，说明投喂小球藻和莴苣叶的植物性饵料有利于螺的胚胎发育。综合来看，室内养殖铜锈环棱螺的饵料应以小球藻为最适饵料，期间可适当辅以鱼饵料进行混合投喂。

2.2 水深优化

由图2可以看出，以15 cm水深组实验螺的体重增长率最大，其次为10 cm水深组，而5 cm水深组的增长率最低，但不同水深组实验螺体重增长率之间没有明显差异(P>0.05)，说明在室内条件下，水深对实验螺体重增长并不是一个主要因子。另外，从各组体重增长率的标准偏差来看，5 cm和20 cm水深组实验螺个体间的差异较大，暗示养殖水过深或过浅可能均不利于螺生长。考虑到螺生长的水环境质量和空间需要，室内养殖的水深最好控制在10 ～ 15 cm为好。

2.3 底质优化

由图3可以看出，细土底质组实验螺体重增长率最高，并且显著高于玻璃底质(P<0.05，Turkeytest)，但与细沙和碎石块组之间没有显著性差异(P>0.05)，这可能是由于土质中含有大量有机质而促进螺的生长。在自然环境中，螺可以栖息在泥质中，并经常吸附在石块、木质等固体附着物上，而沙质则不利于螺的生长，这与实验室结果相近。然而，在实验室条件下，长时间的泥质容易变质而不利于螺生长，这就需要定期更换泥质以保持适于螺的生长环境。当然，由于螺的栖息环境不同，因此对底质的要求也就不同，本文铜锈环棱螺以泥土底质生长最好，而Bulinus nyassanus则在沙底质的环境生长最好[16]，这可能与不同螺在自然界中所处的自然栖息环境有关。因此，底质的选择要根据目标生物在自然环境中的栖息环境并结合室内优化结果做出合适的选择。

2.4 密度优化

从图4可以看出，随着养殖密度增大，实验螺体重增长率呈先增加(从2 个·L-1到6个·L-1)、后降低(从6 个·L-1到12 个·L-1)趋势，并且6 个·L-1组实验螺体重增长率显著高于其它各组(P<0.05)。这个密度明显高于Biomphalaria glabrata室内养殖的密度要求(2 ～ 50 个·L-1)[17]。对于前期随密度增大体重增长率增加，可能是由于个体间存在着一定的协同效应，从而相互促进增长；而后期随着密度增大体重增长率降低，可能是由于密度增加导致单位空间个体间竞争，从而导致体重增加减慢。并且，如果是静水养殖，随着单位密度增大，可能会导致水环境溶解氧水平降低，如高密度螺在静水中养殖4 d后，水体中溶解氧水平明显低于正常养殖密度水体内的溶解氧水平[18]。以上结果说明，螺的室内养殖会存在密度因子限制，这对开展室内相对小空间范围内的养殖系统提出了要求。

图2 水深对螺体重增长的影响Fig. 2 Bellamya aeruginosa body growth at different water depths

图3 底质对螺体重增长的影响Fig. 3 Bellamya aeruginosa body growth at different sediments

图4 密度对螺体重增长的影响Fig. 4 Bellamya aeruginosa body growth at different densities

2.5 Ca2+优化

从图5可以看出，螺体重增长率随着钙离子浓度增加呈先增加(0到30 mg·L-1)、后降低(30到500 mg·L-1)的趋势，并在30 mg·L-1时体重增长率达到最高。另外，10, 30, 100 mg·L-1组与0 mg·L-1组螺体重增长率均具有显著性差异(P<0.05)，说明钙离子对螺生长发育具有重要作用。如当环境中钙离子水平低于2 mg·L-1时，螺个体就会明显减小并且螺壳容易产生畸形[19]。当水环境中钙离子浓度高于300 mg·L-1甚至达到500 mg·L-1时，螺体重增长率反而降低，并且明显低于30 mg·L-1组(P<0.05)，说明钙离子浓度过高时可能会对螺产生毒害作用，从而抑制了体重的增长，这与Mishkin and Jokinen结果一致[15]。以上结果说明，水体中钙离子浓度处于30 mg·L-1时最为适合螺的生长发育，这与Biomphalaria glabrata (say)对环境钙水平的要求相似[15]。这明显低于我国生活饮用水中硬度标准(硬度(CaCO3)：450 mg·L-1；折合钙离子：180 mg·L-1)(GB 5749-2006)，这就要求在螺的室内养殖中，需要对钙离子进行适当控制。

2.6 麻醉剂优化

麻醉剂对螺的麻醉效果见图6。从麻醉时间来看，在30 min后MgCl2各组均产生一定的麻醉效果，其中10 和20 g·L-1组的麻醉率超过了50%，并且显著高于0.5 g·L-1组(P<0.05)，在150 min后达到了80%，而20 g·L-1组则为100%(图6-(a))。而从恢复效果来看，只有低浓度(0.5, 1 和5 g·L-1)组能够全部恢复活力(4.5～6.5 h)，而高浓度组(10和20 g·L-1)的恢复率分别只有66.67%和40%(6.5 h)。对于其它麻醉剂(图6-(b)、(c)、(d)和(e))，只有10%乙醇浓度组和300 mg·L-1的盐酸普鲁卡因在30 min时产生了较弱的麻醉作用(10%～20%)，其它各组的麻醉率直到90 min后超过50%。从恢复效果来看，乙醇组的恢复效果最好，低浓度组(0.5%，1%和3%)在6.5 h后恢复率均到达了100%，高浓度组(5%和10 %)的恢复率也超过了50%。另外，高浓度乙醇(5%和10%)的麻醉率显著高于低浓度(0.5%)(P<0.05)，同样，高浓度丁香酚(10 mg·L-1)的麻醉率也显著高于低浓度(0.5 mg·L-1)的麻醉率(P<0.05)。而丁香酚、盐酸普鲁卡因和MS-222在6.5 h后只有最低浓度组的恢复率达到了100%，其它各组只有50%左右甚至更低，并且各处理组之间的麻醉率的差异不显著(P>0.05)。综上所述，MgCl2(5～10 g·L-1)对螺的麻醉效果最好，其次为乙醇，其余3种则没有明显区别。

综上所述，在室内养殖模式下，以泥土底质、密度为6 个·L-1、水深10～15 cm、水体钙离子浓度为30 mg·L-1，并投喂小球藻可作为铜锈环棱螺的适宜养殖条件；在生物麻醉处理时，MgCl2可作为实验处理的首选药剂。

图5 钙离子对体重增长的影响Fig. 5 Bellamya aeruginosa body growth at different calcium ion levels

图6 麻醉剂对螺的麻醉效果Fig. 6 Effects of different anesthetics for Bellamya aeruginosa

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A Study of the Laboratory Conditions ofBellamyaaeruginosa

Qiang Fan1,2, Bingchun Tao1, Bo Wang2, Zeyan Zhang2, Rui Zeng2, An Lihui2,*

1. Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China 2. State Environmental Protection Key Laboratory of Estuarine and Coastal Research, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China

Received 17 October 2014 accepted 29 November 2014

Bellamya aeruginosa could be used as a potential ecotoxicological model organism; however, the first requirement for future research is to optimize laboratory conditions. The present study optimized food, water depth, bottom materials, density, and calcium ion concentration for Bellamya aeruginosa cultured under artificial conditions using weight gain ratio as the endpoint, and then followed by evaluation of different anesthetics including MgCl2·2H2O, ethanol, eugenol, procaine hydrochloride and MS-222. Results indicated that growth was optimal with the following conditions: feeding fresh C. vulgaris, culturing at a density of 6 number·L-1, keeping the water depth at 10 ～ 15 cm, using fine soil as the bottom material and keeping the calcium ion concentration at 30 mg·L-1. Furthermore, results showed that MgCl2·2H2O should be the primary choice of anesthetic for this organism. These conditions will result in proper rearing and maintenance of Bellamya aeruginosa for use as a model organism in future.

Bellamya aeruginosa; model organism; culture condition; anesthetic; optimization

国家水体污染控制与治理科技重大专项(2013ZX07501005)；国家自然科学基金项目(21177117)

范强(1990-)，男，硕士研究生，研究方向为水生毒理学，E-mail: s0804014121@126.com

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: anlhui@163.com

10.7524/AJE.1673-5897-20141017002

2014-10-17 录用日期：2014-11-29

1673-5897(2015)3-200-09

X171.5

A

安立会(1975-)，男，环境科学博士，副研究员，主要研究方向为生态毒理学，发表学术论文30余篇。

范强，陶秉春，王博, 等. 铜锈环棱螺室内实验条件优化[J]. 生态毒理学报, 2015, 10(3): 200-208

Fan Q, Tao B C, Wang B, et al. A study of the laboratory conditions of Bellamya aeruginosa [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(3): 200-208 (in Chinese)