连夏配方颗粒对心肌梗死后大鼠心梗周围区神经生长因子mRNA、酪氨酸激酶受体A mRNA表达的影响

李家立　李平　马洪皓　白芳芳　田辰　郝腾　赵利　朱国东

连夏配方颗粒对心肌梗死后大鼠心梗周围区神经生长因子mRNA、酪氨酸激酶受体A mRNA表达的影响

李家立李平马洪皓白芳芳田辰郝腾赵利朱国东

【摘要】目的观察连夏配方颗粒对心肌梗死后大鼠心梗周围区心肌组织神经生长因子(nerve growth factor, NGF)mRNA、酪氨酸激酶受体A(tyrosine kinase receptor A，TrKA)mRNA表达的影响。方法将90只清洁级健康7周龄Wistar雄性大鼠随机分为假手术组、心梗模型组、美托洛尔组、连夏配方颗粒高、中、低剂量(189.00、94.50、47.25 mg/kg)组。各组均结扎左冠状动脉前降支以复制心肌梗死大鼠模型，假手术组只穿线，不结扎。假手术与心梗模型组大鼠予生理盐水，余各组予相应实验药物；连续灌胃给药30天，采用Real-time RT-PCR方法检测心梗周围区NGF mRNA、TrKA mRNA表达水平。结果与假手术组比较，心梗模型组大鼠心梗周围区心肌组织NGF mRNA、TrKA mRNA表达均明显增高(P<0.01)；与模型组比较，连夏配方颗粒高、中、低剂量组大鼠心梗周围区NGF mRNA表达均明显降低(P<0.01)；连夏配方颗粒高、中剂量组大鼠心梗周围区TrKA mRNA表达均明显降低(P<0.01)；与美托洛尔组比较，连夏配方颗粒高剂量组大鼠心梗周围区NGF mRNA表达明显降低(P<0.05)。结论连夏配方颗粒可显著降低心肌梗死后大鼠心梗周围区心肌组织NGF mRNA、TrKA mRNA的表达，达到改善心肌梗死后大鼠心梗周围区自主神经重构的作用。

【关键词】连夏配方颗粒；心肌梗死；自主神经重构；神经生长因子；酪氨酸激酶受体A

神经生长因子(nerve growth factor, NGF)作为最先被发现的神经营养因子,具有促进神经细胞存活和生长发育的作用[1-3]。而酪氨酸激酶受体A(tyrosine kinase receptor A, TrkA)可激活多个胞内信号通路参与NGF介导的神经细胞轴突生长、神经元分化存活以及神经元特性的维持等诸多过程,是NGF信号转导通路上的重要信号蛋白[2-6]。

本研究通过复制心肌梗死大鼠模型，连续灌胃给予实验药物，旨在观察中药小复方连夏配方颗粒(组名中简称连夏)对心肌梗死后大鼠心梗周围区NGF mRNA、TrKA mRNA表达的影响，探讨连夏配方颗粒对心肌梗死后大鼠心梗周围区自主神经重构的作用机制。

1材料与方法

1.1实验动物

清洁级健康7周龄Wistar雄性大鼠90只，北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证：SCXK(京)2009-0007。

1.2主要药品与试剂

连夏配方颗粒，北京康仁堂药业有限公司。酒石酸美托洛尔片，阿斯利康制药有限公司，批号：1103070C。UltraSYBR Mixture(With ROX)(CW0956)、超纯RNA提取试剂盒(CW0581)、DNase 1(CW2090)、5xRNA Loading Buffe(CW0611A)、HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒(CW0744)等均购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.3主要仪器

分光光度计(NANODROP 2000, Therno scientific)、涡旋振荡仪(QL-902, 海门其林贝尔仪器公司)、荧光定量PCR仪(ABI7500, Applied Biosystems)、离心机(Centrifuge 5415D, Eppendorf)等。

1.4分组与给药

将90只大鼠随机分为假手术组、心梗模型组、美托洛尔组、连夏高、中、低剂量(189.00、94.50、47.25 mg/kg)组，每组15只。假手术组、心梗模型组大鼠分别予0.9%生理盐水10 mL/kg灌胃，美托洛尔组大鼠予美托洛尔100 mg/kg灌胃，连夏配方颗粒高、中、低剂量组大鼠分别给予相应剂量连夏配方颗粒灌胃；模型建立的当天即灌胃给药；每天给药1次，连续进行30天；每天每只大鼠0.9%生理盐水的灌胃量均为10 mL/kg。最终每组取3只大鼠进行指标检测。

1.5模型复制

大鼠模型复制采用手术结扎法[7]，经用3.5%水合氯醛10 mL/kg剂量腹腔麻醉，仰卧固定大鼠后，于左侧第4、5肋间切口，打开胸腔、心包，轻压胸廓挤出心脏，结扎冠状动脉左前降支，后立即将心脏放回，关闭切口，缝合皮肤，局部应用青霉素防感染。假手术组大鼠只穿线不结扎。

1.6取材与指标检测

给药30天后进行取材：腹腔麻醉，取心梗周围相同区域心肌组织，迅速放入液氮降温后，转移至-80℃冰箱保存。采用Real-time RT-PCR方法进行指标检测：取心肌组织100 mg，用RNA提取试剂盒提取组织样本中总RNA，取总RNA 1 μL以紫外分光光度计测定RNA纯度、浓度，计算OD260/OD280比值，比值在1.8～2.0之间视为纯度较高、完整性较好，否则重新提取RNA，并计算总RNA浓度。按照试剂盒说明书进行逆转录，合成cDNA，再进行cDNA扩增，引物序列见表1。用ABI7500型荧光定量PCR仪，采用2-△△CT法计算目的基因的表达变化。实验步骤参照试剂盒说明书及文献[8-9]进行。

表1　引物序列

1.8统计学方法

2结果

2.1对心肌组织NGF mRNA表达的影响

与假手术组比较，心梗模型组大鼠心肌梗死周围区心肌组织NGF mRNA明显升高(P<0.01)。给药30天后，与心梗模型组比较，美托洛尔组大鼠NGF mRNA明显降低(P<0.01)；连夏配方颗粒高、中、低剂量组大鼠NGF mRNA均明显降低(P<0.01)。与美托洛尔组比较，连夏配方颗粒高剂量组大鼠NGF mRNA明显降低(P<0.05)。说明连夏配方颗粒可以显著改善心肌梗死后大鼠心梗周围区心肌组织NGF mRNA的表达，上述差异均有统计学意义，见表2。

组别 NGFmRNA假手术组(n=3) 0.51±0.06心梗模型组(n=3) 1.49±0.16a美托洛尔组(n=3) 0.97±0.04ab连夏高剂量组(n=3) 0.78±0.09abc连夏中剂量组(n=3) 0.96±0.04ab连夏低剂量组(n=3) 1.09±0.12ab

注：与假手术组比较，aP<0.01；与心梗模型组比较，bP<0.01；与美托洛尔组比较，cP<0.05

2.2对心肌组织TrKA mRNA表达的影响

与假手术组比较，心梗模型组大鼠心肌梗死周围区心肌组织TrKA mRNA明显升高(P<0.01)。给药30天后，与心梗模型组比较，美托洛尔组大鼠TrKA mRNA明显降低(P<0.01)；连夏配方颗粒高、中剂量组大鼠TrKA mRNA均明显降低(P<0.01)。与美托洛尔组比较，连夏配方颗粒高剂量组大鼠TrKA mRNA无明显变化(P>0.05)。说明连夏配方颗粒可以明显改善心肌梗死后大鼠心梗周围区心肌组织TrKA mRNA表达，上述差异均有统计学意义，见表3。

3讨论

NGF是最早被发现的神经营养因子家族成员，包括α、β、γ三个亚基，其中的β亚基则是NGF的活性亚单位，发挥NGF的全部生物学效应。NGF可以促进感觉神经元及交感神经元的存活及分化，参与损伤修复，维持神经元生物学功能的稳定；对此在控制神经系统的生长、发育、存活和再生等方面研究较为广泛[2-3, 10]。研究指出，除外源性NGF，心肌细胞也可以自主合成并分泌NGF。它在心肌受损后立刻被释放到相应部位，促进心脏神经的生长及受损去甲肾上腺素能神经元的再生，因此可能参与心肌梗死后心脏自主神经失支配、再生和过度支配过程，进而与心肌梗死后致命性心律失常的发生密切相关[11-13]。

表3各组大鼠心肌组织TrKA mRNA表达的影响

组别TrKAmRNA假手术组(n=3)0.68±0.04心梗模型组(n=3)1.92±0.07a美托洛尔组(n=3)0.95±0.05ab连夏高剂量组(n=3)0.86±0.04ab连夏中剂量组(n=3)1.27±0.07abc连夏低剂量组(n=3)1.89±0.10ac

注：与假手术组比较,aP<0.01；与心梗模型组比较,bP<0.01；与美托洛尔组比较,cP<0.01

TrkA是NGF的高亲和力受体，与NGF具有较高的亲和力；它是一种由TrkA原癌基因表达的、具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜蛋白[2, 4-5, 14]，其下游通路主要包括有丝分裂素活化蛋白激酶(MAPK)通路、PI3K/Akt通路和PLCγ通路等[3, 6, 10, 15]。TrKA一般介导正性信号，与到目前为止研究仍不明确、主要介导负性信号的NGF低亲和力受体p75受体(p75 NTR)一起调控着神经生长、存活和分化[16-17]。

本实验结果表明，中药小复方连夏配方颗粒可以显著降低心肌梗死后大鼠心梗周围区心肌组织NGF和TrKA两者的mRNA表达水平。研究显示，连夏配方颗粒之所以能够显著改善心肌梗死后大鼠心梗周围区心脏交感神经与迷走神经的再生重构[18]，其作用机制可能与连夏配方颗粒可以有效降低心肌梗死周围区心肌组织NGF mRNA与TrKA mRNA表达有关，但其具体作用机制尚需进一步研究。

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(本文编辑：黄凡)

·论著·

作者单位：100069首都医科大学中医药学院[邹大威、高彦彬、李娇阳(硕士研究生)、周盛楠(硕士研究生)、王馨瑶(硕士研究生)、龚慕辛、耿建国、王金羊(博士研究生)、朱智耀、张娜(博士研究生)]；中医络病研究北京市重点实验室[邹大威、高彦彬、李娇阳(硕士研究生)、周盛楠(硕士研究生)、王馨瑶(硕士研究生)、龚慕辛、耿建国、王金羊(博士研究生)、朱智耀、张娜(博士研究生)]

Effects ofLianXiaFormula Granule on NGF mRNA and TrKA mRNA expression level at infarcted border zone of rats after myocardial infarctionLIJia-li,LIPing,MAHong-hao,etal.BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of LianXia Formula Granule (LXFG) on NGF mRNA、TrKA mRNA expression level at infarcted border zone of rats after myocardial infarction (MI). MethodsNinty healthy male Wistar rats were randomly assigned to six groups: sham operated group, model group, metoprolol group, high, middle and low-dose of LXFG group (189.00, 94.50, 47.25 mg/kg). The sham operated rats were not ligated in the left anterior descending coronary artery except the rest groups. The sham operated group and model group were given with normal saline by intragastric administration, and the rest groups were given with medicine for testing. 30 days later, NGF mRNA, TrKA mRNA expression level were separately measured in all groups. ResultsCompared with the model group, NGF mRNA expression level in the high, middle and low-dose of LXFG group decreased (P<0.01) and TrKA mRNA expression level in the high and middle-dose of LXFG group decreased (P<0.01). Compared with the metoprolol group, NGF mRNA expression level in the high-dose of LXFG group decreased (P<0.05). ConclusionApplication of LianXia Formula Granule in rats after MI can significantly decrease the expression level of NGF mRNA、TrKA mRNA to improve cardiac autonomic neural remodeling.

【Key words】LianXia Formula Granule;Myocardial Infarction;Cardiac Autonomic Neural Remodeling;Nerve growth factor;Tyrosine kinase receptor A

通讯作者：高彦彬(1959- )，博士，教授，博士生导师。研究方向：中医药防治糖尿病及其并发症研究。E-mail：dfyynfm@163.com

作者简介：邹大威(1982- )，女，博士，讲师。研究方向：中医药防治糖尿病及其并发症研究。E-mail：5362559@qq.com

基金项目：北京市教育委员会首都中医药研究专项面上项目(13ZY07)

(收稿日期：2015-01-26)

Corresponding author:LI Ping, E-mail: pearll2008@126.com

【中图分类号】R285.5

【文献标识码】A

doi:10.3969/j.issn.1674-1749.2015.03.010