蒸煮助剂对低用碱量硫酸盐法预处理毛竹竹屑的影响

黄曹兴，谢益晖，李 鑫，勇余世袁

(南京林业大学 化学工程学院，江苏 南京 210037)

·研究报告——生物质化学品·

蒸煮助剂对低用碱量硫酸盐法预处理毛竹竹屑的影响

(南京林业大学 化学工程学院，江苏 南京 210037)

毛竹竹屑经10%低用碱量(以Na2O计)、 20%硫化度、 160 ℃下保温1 h预处理，木质素脱除率达到62.35%，预处理物料酶水解48 h葡萄糖和木糖得率分别为56.04%和53.47%。研究了硼氢化钠、三聚磷酸钠、 2-蒽醌磺酸钠3种蒸煮助剂对毛竹竹屑10%用碱量硫酸盐预处理的成分以及糖化效果影响，其中2-蒽醌磺酸钠影响最大。在10%用碱量和20%硫化度的预处理液中添加0.15%的2-蒽醌磺酸时，160 ℃下保温1 h的葡聚糖回收率和木质素脱除率分别为94.93%和68.55%，与空白对比分别提高5.45%和9.94%；预处理物料酶解48 h葡萄糖和木糖得率分别为62.88%和58.97%，与空白对比分别提高12.21%和10.29%。

毛竹竹屑；蒸煮助剂；硫酸盐蒸煮；低用碱量；酶水解

原料预处理是木质纤维素生物炼制能源、化学品的关键技术[1]。多年生毛竹原料中木质素含量高，常规的以降解、溶解半纤维素为目的来实现原料中纤维素、半纤维素和木质素分离的稀酸预处理、蒸汽爆破预处理对促进毛竹纤维素糖化效果不大[2]，而以脱木质素为目的的碱性预处理方法适宜于毛竹等高木质素含量生物质的预处理[3]。尽管烧碱法等碱性预处理技术在木质纤维素的预处理中已取得良好的效果，但这些预处理方法在脱木质素时仅断裂木质素分子中的α-芳基醚键、α-烷基醚键、甲基芳醚键和γ-脂键等，而对β-芳基醚键的断裂作用较小[4]。多年生毛竹组织结构紧密且木质素含量高(25%～35%)，木质素酚型单元中70%以上为β-芳基醚键，蒸煮过程中药液渗透较木片困难、脱木质素效果较差，常规的碱性预处理方法难以取得理想的效果[5]。制浆造纸工业中的硫酸盐法(NaOH+Na2S)预处理具有深度脱木质素的效果，预处理液中加入的Na2S产生亲和性强的S2-和HS-，能使大部分β-芳基醚键断裂和95%木质素溶出[6]。但传统的硫酸盐法预处理用碱量一般较高，达14%～28%[7]，预处理过程中脱除大部分木质素的同时纤维素和半纤维素的剥皮反应和碱性水解也加剧，将降低后续纤维素糖化的总糖得率，因此研究较多集中在条件温和的绿液预处理法(Na2CO3+Na2S)[8]、碱性亚硫酸盐预处理法(Na2SO3)[9]等方法上。虽然众所周知硫酸盐法预处理中添加助剂既可提高药液的渗透性和脱木质素能力，又可减少碳水化合物的降解[10]，但未见有报道将蒸煮助剂应用到木质纤维原料的生物炼制中。因此作者系统的研究了毛竹竹屑在低用碱量(10%)硫酸盐预处理时添加硼氢化钠、三聚磷酸钠和2-蒽醌磺酸钠助剂对毛竹纤维素、半纤维素回收率、木质素脱除率以及纤维素糖化的影响，以期为高木质素生物质制取可发酵性糖的工业化提供依据。

1 实 验

1.1 原料与试剂

竹屑，毛竹工业加工剩余物，粒度为10～25 mm，由福建何其昌竹业有限公司提供。主要成分：葡聚糖39.22%(干基)，木聚糖19.69%(干基)，木质素32.75%(干基)。

纤维素酶，滤纸酶活力117 FPU/g，β-葡萄糖苷酶活力22.5 U/g；β-葡萄糖苷酶，β-葡萄糖苷酶酶活力323 U/g；木聚糖酶，木聚糖酶酶活力174.5 U/g，购于Sigma公司。Na2S和NaOH购于南京化学试剂有限公司；硼氢化钠、三聚磷酸钠、 2-蒽醌磺酸钠购于国药集团化学试剂有限公司，均为化学纯。

1.2 原料预处理

硫酸盐法预处理液：由NaOH和Na2S配制而成。其中用碱量指有效碱用量，包括NaOH和Na2S(浓度以Na2O计)，硫化度指预处理液中Na2S相对Na2O的质量分数。NaOH和Na2S添加量计算参照公式(1)和(2)。

硫酸盐法预处理：在1 L×10个的油浴锅中进行。100 g绝干竹屑装入1 L不锈钢管式蒸煮器中，按固液比1 ∶5(g ∶mL)加入硫化度20%、用碱量为2%～10%和12%～28%的预处理液。在80 ℃下预浸20 min后，以2 ℃/min 的速率升温至160 ℃，保温1 h。反应结束后立即将蒸煮器取出浸于冷水中，预处理渣磨浆后用蒸馏水洗涤至中性，过滤后得到预处理竹屑。预处理竹屑装入密封袋中，于4 ℃冰箱中平衡水分2 d，备用分析。预处理竹屑各成分变化计算参照公式(3)～(5)。

低用碱量添加蒸煮助剂预处理：在用碱量10%和硫化度20%的预处理液中分别加入1%～5%硼氢化钠、 0.1%～0.5%三聚磷酸钠和0.03%～0.15%的2-蒽醌磺酸钠，添加量以100 g竹屑为基准。预处理操作步骤与常规硫酸盐法预处理一致。

1.3 预处理竹屑糖化

预处理物料于底物质量浓度0.05 g/mL、纤维素酶用量30 FPU/g(以葡聚糖为基准，下同)、β-葡萄糖苷酶用量30 U/g、木聚糖酶120 U/g、 pH值4.8、 50 ℃条件下酶水解48 h。水解结束后于10 000 r/min下离心5 min，取上清液测定水解液中糖浓度。单糖得率计算参照公式(6)和(7)。

1.4 分析方法

1.4.1 原料化学组成分析 毛竹竹屑和预处理竹屑中葡聚糖、木聚糖、木质素等含量的分析均按美国能源部可再生能源实验室(NREL)的方法测定[11]。

1.4.2 酶活力测定 滤纸酶活力的测定采用国际理论和应用化学协会(IUPAC)推荐的标准方法[12]：一个滤纸酶活力单位定义为每分钟生成1 μmol葡萄糖所需的酶量；β-葡萄糖苷酶酶活力的测定采用对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(pNPG)试剂方法[13]：一个β-葡萄糖苷酶酶活力单位定义为每分钟生成1 μmol对硝基苯酚所需要的酶量；木聚糖酶酶活力测定参考文献[14]：一个木聚糖酶活力单位(IU)定义为每分钟生成1 μmol木糖所需的酶量。

1.4.3 可发酵性单糖定量分析 葡萄糖和木糖定量分析在美国Agillent 1260型高效液相色谱仪上进行。采用Bio-Rad HPX-87H 柱(7.8 mm×300 mm)，柱温55 ℃，流动相5 mmol/L的硫酸，流速0.6 mL/min，上样量10 μL，示差折光检测器，采用外标法测定。

1.5 计算公式

NaOH用量=100 g×用量碱×(1-硫化度)×1.29

(1)

Na2S用量=100 g×用量碱×硫化度×1.26

(2)

葡聚糖回收率=100 g竹屑预处理后葡聚糖质量/39.22 g×100%

(3)

木聚糖回收率=100 g竹屑预处理后木聚糖质量/19.69 g×100%

(4)

木质素脱除率=(32.75 g-100 g竹屑预处理木质素质量)/32.75 g×100%

(5)

葡萄糖得率=水解液中葡萄糖质量/(酶解底物中葡萄糖含量×1.11)×100%

(6)

木糖得率=水解液中木糖质量/(酶解底物中木糖含量×1.14)×100%

(7)

提高率=(添加助剂后的得率-未添加助剂的得率)/未添加助剂的得率×100%

(8)

式中： 100 g— 预处理时竹屑用量； 1.29— NaOH与Na2O换算系数； 1.26— Na2S与Na2O换算系数； 39.22 g— 100 g未处理竹屑中含有的葡聚糖质量； 19.69 g— 100 g未处理竹屑中含有的木聚糖质量； 32.75 g— 100 g未处理竹屑中含有的木质素质量； 1.11—葡聚糖和葡萄糖转化系数； 1.14—木聚糖和木糖转化系数。

2 结果与分析

2.1 用碱量对竹屑预处理的影响

竹屑经硫酸盐预处理时，于高用碱量12%～28%和低用碱量2%～10%、硫化度20%、温度160 ℃下保温1 h，葡聚糖和木聚糖回收率、木质素脱除率及预处理物料糖化效果如表1所示。由表1可知，常规硫酸盐法预处理过程中随着用碱量的增加，竹屑成分中葡聚糖、木聚糖回收率降低，木质素脱除率提高。当用碱量从12%增加到28%时，葡聚糖、木聚糖回收率分别从88.82%和57.28%降低到82.33%和30.61%，木质素脱除率从83.42%提高到95.80%。当用碱量为28%时葡萄糖得率能达到74.21%，但预处理原料的葡聚糖和木聚糖回收率仅为82.33%和30.61%。从生物炼制角度出发，虽然高的木质素脱除率有利于纤维素和半纤维素糖化，但剧烈条件下发生的碱性水解和剥皮反应会使原料中大部分聚糖降解，将会降低后续糖化的总糖得率[1]。

表1 用碱量对竹屑主要成分回收率和木质素脱除率的影响

由表1又可知，虽然竹屑在低用碱量10%时木质素脱除率最高仅为62.35%，但葡萄糖和木糖得率均在50%以上，说明低用碱量预处理也可以实现较高的糖化效果。在相同的酶水解条件下，Gu[15]等利用绿液(Na2CO3+Na2S)预处理研究玉米秸秆木质素脱除率对纤维素酶水解的影响时发现，当木质素脱除率达到65%时可有效提高葡聚糖的糖化率到70%以上。竹屑经10%用碱量的硫酸盐法预处理后，木质素脱除率达到62.35%，而葡萄糖得率仅为56.04%。分析原因可能是：1)一年生的玉米秸秆结构松散，多年生毛竹木质化程度高、组织结构密度大且化学结构特殊[2]，虽然预处理时木质素脱除率相当，但竹屑组织结构的破坏程度不如玉米秸秆，酶对竹屑的纤维素和半纤维素可及度低； 2)预处理之后，竹屑中残留的木质素对纤维素酶吸附能力可能高于玉米秸秆中的木质素，而该吸附属于非生产性吸附，因此预处理竹屑的酶水解得率低[16]。

2.2 蒸煮助剂对竹屑预处理及酶解的影响

2.2.1 蒸煮助剂对竹屑预处理的影响 竹屑在10%用碱量时添加不同蒸煮助剂进行硫酸盐预处理，助剂添加量对葡聚糖、木聚糖回收率和脱木质素的影响如表2所示。由表2可知，添加硼氢化钠、三聚磷酸钠和2-蒽醌磺酸钠3种蒸煮助剂均有利于预处理竹屑的葡聚糖回收率和木质素脱除率的提高，助剂添加量越大，抑制碳水化合物碱性水解的作用越明显，木质素脱除率越高。

表2 不同助剂对竹屑硫酸盐法预处理碳水化合物回收率和木质素脱除率的影响

当NaBH4添加量为3%时葡聚糖回收率达到最高，为92.73%，提高率为3.01%。进一步增加NaBH4添加量至5%，葡聚糖回收率下降为92.03%，这可能是过量的硼氢化钠使纤维素中β-1,4-糖苷键断裂，促进纤维素降解[17]。当NaBH4添加量为5%时，木聚糖回收率和木质素脱除率达到最高，分别为63.52%和64.93%，与空白对比提高率为7.48%和4.14%。NaBH4是一种强还原剂，可使碳水化合物还原性末端的羰基还原成羟基，阻止碳水化合物在蒸煮时发生剥皮反应，有利于降低葡聚糖和木聚糖在碱性蒸煮过程中的降解[17]。

三聚磷酸钠在碱性蒸煮过程中能够吸附原料中的金属离子而抑制自由基的产生，减少自由基对碳水化合物的攻击，从而起到保护葡聚糖和木聚糖的作用[18]。同时，三聚磷酸钠能够增加蒸煮药液的反应活性，可与木质素单元侧链上的不饱和键反应，从而提高脱木质素能力[18]。当三聚磷酸钠添加量为0.5%时，预处理竹屑葡聚糖回收率和木质素脱除率分别为93.58%和66.50%，与空白对比提高率为3.95%和6.66%；而木聚糖回收率从59.10%下降到57.15%，这是因为部分木聚糖与木质素间会以酯键、α-苯醚键、γ-酯键及苯苷键等键型连接[19]，木质素脱除率增加同时会分离出更多的木聚糖，而在碱性条件下木聚糖易发生碱性降解和剥皮反应[15]，因此在硫酸盐法预处理过程中木聚糖回收率会随着木质素脱除率的增加而减少。

2-蒽醌磺酸钠在硫酸盐法预处理过程中能氧化碳水化合物还原性的醛末端基成糖醛酸末端基，从而减弱蒸煮过程中碳水化合物的剥皮反应[20]。同时，蒽醌及其衍生物在蒸煮过程中被还原成蒽氢醌(AHQ)之后形成的蒽酚酮离子(AHQ-)能够促进木质素酚型结构中β-芳基醚键断裂，从而提高脱木质素能力[4]。从表2数据可以看出，添加2-蒽醌磺酸钠能够提高葡聚糖回收率和木质素脱除率。当2-蒽醌磺酸钠添加量为0.15%时，葡聚糖回收率和木质素脱除率分别为94.93%和68.55%，提高率为5.45%和9.94%。

2.2.2 蒸煮助剂对预处理竹屑碳水化合物糖化单糖得率的影响 蒸煮助剂对预处理竹屑碳水化合物糖化单糖得率的影响如图1。

图1 蒸煮助剂对预处理竹屑碳水化合物糖化的影响

由图1可知，蒸煮过程中添加助剂有利于碳水化合物葡聚糖和木聚糖糖化效率的提高。当预处理液中添加5%的NaBH4时，预处理物料酶解48 h的葡萄糖和木糖得率分别为58.77%和56.19%；当添加0.5%的三聚磷酸钠时，酶解时葡萄糖和木糖得率分别为60.84%和58.08%；添加2-蒽醌磺酸钠对提高得率影响最大，当2-蒽醌磺酸钠添加量为0.15%时，葡萄糖和木糖得率分别为62.88%和58.97%，提高率为12.21%和10.29%。造成不同助剂对预处理竹屑酶解效果差异的原因可能是木质素脱除率的差异，木质纤维原料酶水解效率与物料中木质素含量呈正相关，一定程度上木质素脱除率越高，纤维素酶和木聚糖酶对葡聚糖和木聚糖的可及性越高，酶水解效果就越好[15]。预处理液中添加0.15%的2-蒽醌磺酸钠时竹屑木质素脱除率最高(68.55%)，而添加0.5%的硼氢化钠和三聚磷酸钠竹屑木质素脱除率分别为64.93%和66.50%，因此，竹屑蒸煮过程中添加2-蒽醌磺酸钠更有利于提高预处理物料中碳水化合物的糖化率。

3 结 论

3.1 竹屑经低用碱量硫酸盐法(NaOH+Na2S)预处理，可获得较高的碳水化合物，同时能脱除部分木质素，从而实现原料中纤维素、半纤维素和木质素的有效分离，提高葡聚糖和木聚糖糖化效率。竹屑经10%用碱量(以Na2O计)、 20%硫化度、 160 ℃下保温1 h预处理，木质素脱除率达到62.35%，预处理物料酶水解48 h葡萄糖和木糖得率分别为56.04%和53.47%。

3.2 添加硼氢化钠、三聚磷酸钠和2-蒽醌磺酸钠3种蒸煮助剂均有利于竹屑硫酸盐法预处理过程中碳水化合物回收率、木质素脱除率、糖化效率的提高，其中2-蒽醌磺酸钠影响最大。当预处理液中2-蒽醌磺酸钠添加量为0.15%时，葡聚糖回收率和木质素脱除率分别为94.93%和68.55%，与空白对比提高率为5.45%和9.94%；预处理竹屑酶解48 h的葡萄糖和木糖得率分别为62.88%和58.97%，与空白对比提高率为12.21%和10.29%。

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Effect of Cooking Additives on Moso Bamboo Residues Pretreated by Kraft Pulping with Low Alkali Dosage

HUANG Cao-xing，XIE Yi-hui，LI Xin，YONG Qiang，YU Shi-yuan

(College of Chemical Engineering,Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China)

In this work,kraft pulping with low alkali dosage was carried out on moso bamboo residues as a pretreatment.62.35% lignin was removed in kraft pulping pretreatment with 10% effective alkali charge,20% sulfidity,160 ℃,and 1 h holding time.Consequently,the yields of glucose and xylose were about 56.04% and 53.47%,respectively,with enzymatic saccharification of the pretreated sample for 48 h.Meanwhile,the effects of cooking additives,i.e.,sodium borohydride,sodium tripolyphosphat,and 2-anthraquinone sodium sulfonate,on bamboo residues composition and enzymatic hydrolysis after kraft pulping pretreatment were investigated.The results indicated that cooking additives had positive effects on the cellulose recovery,degree of delignification,and enzymatic digestibility of pretreated bamboo residues.Among them,the 2-anthraquinone sodium sulfonate had the maximal effects.When the dosage of 2-anthraquinone sodium sulfonate was 0.15%,the cellulose recovery and delignification rate were 94.93% and 68.55%,respectively,and increased by 5.45% and 9.94% than those of blank;the glucose and xylose hydrolysis yields in the enzymatic hydrolysis of pretreated sample for 48 h were 62.88% and 58.97%,respectively,which increased by 12.21% and 10.29% compared with those of blank.

Mosobamboo residues;cooking additives;kraft pulping;low alkali charge;enzymatic hydrolysis

10.3969/j.issn.1673-5854.2015.01.006

2014- 10- 14

国际先进林业技术引进项目(2012-4-18)；江苏高校自然科学重大基础研究项目(11KJA220004)；江苏省自然科学基金(BK20131426) 作者简介：黄曹兴(1989— )，男，福建福清人，博士生，研究领域：林产化学加工；E-mail:szxapy@163.com

TQ35

A

1673-5854(2015)01- 0033- 06

*通讯作者：勇 强，教授，博士生导师，主要从事生物质资源生物降解与转化的研究；E-mail:swhx@njfu.com.cn。