银杏叶聚戊烯醇纳米乳液的制备研究

陶 冉，王成章，张宇思，叶建中，周 昊1,，陈虹霞

(1.中国林业科学研究院 林业新技术研究所，北京 100091； 2.中国林业科学研究院 林产化学工业研究所；生物质化学利用国家工程实验室；国家林业局 林产化学工程重点开放性实验室；江苏省 生物质能源与材料重点实验室，江苏 南京 210042)

·研究报告——生物质活性成分·

银杏叶聚戊烯醇纳米乳液的制备研究

陶 冉1，2，王成章，张宇思2，叶建中2，周 昊1,2，陈虹霞2

(1.中国林业科学研究院 林业新技术研究所，北京 100091； 2.中国林业科学研究院 林产化学工业研究所；生物质化学利用国家工程实验室；国家林业局 林产化学工程重点开放性实验室；江苏省 生物质能源与材料重点实验室，江苏 南京 210042)

以银杏叶聚戊烯醇为原料，Span-80与Tween-80为乳化剂，采用反相乳化(EIP)法，制备聚戊烯醇的水包油型纳米乳液，分别对影响聚戊烯醇纳米乳液性能的乳化剂的亲水疏水平衡(HLB)值、乳化剂与聚戊烯醇的比例、搅拌时间、乳化温度和搅拌速度等因素进行单因素考察。并对搅拌时间、乳化温度和搅拌速度进行3因素3水平的Box-Behnken响应面分析。结果显示：当乳化剂HLB值为9.5，乳化剂与聚戊烯醇质量比为1.75 ∶1，搅拌时间为12 min，乳化温度为60 ℃以及搅拌速度为17 000 r/min时，聚戊烯醇纳米乳液平均粒径最小，为97 nm，与模型模拟值(92 nm)的RSD为2.7%(<5%)，粒径分布系数为0.383，说明该模型模拟得到的最佳工艺参数对实际操作的预测较为可靠，具有一定的指导意义。优化后的聚戊烯醇纳米乳液的离心稳定性、贮藏稳定性、分散性以及冻融后分散性均达到1级，乳液呈现出良好的均匀性；而冻融后离心乳液会初现稠度不均的情况，即2级水平，并保持该状态。

银杏；聚戊烯醇；纳米乳液；响应面法

银杏GinkgobilobaL.叶含有多种生物活性成分，包括黄酮、萜内酯、多糖、聚戊烯醇、挥发油及甾醇等成分[1]，银杏叶是银杏重要的药用部位。银杏叶聚戊烯醇(GBP)是继银杏黄酮和内酯后发现的一类重要天然活性成分，它是由14～24个异戊烯基单元组成的长链状类脂同系物。聚戊烯醇是生物体细胞膜中糖蛋白合成过程中的重要活性成分，参与生物体内多种代谢，生物活性十分广泛[2]。聚戊烯醇分子质量大，具有强疏水性，导致聚戊烯醇在人体和动物体内的生物利用度较低，更影响其生物活性研究以及相关制剂开发。因此，将聚戊烯醇通过化学或物理方法进行亲水改性，是解决聚戊烯醇制剂开发及其生物利用问题的关键。对聚戊烯醇化学改性通常是通过对聚戊烯醇末端羟基进行取代，通过引入亲水基团达到改性目标[3]；对聚戊烯醇物理改性可以采用制备聚戊烯醇纳米乳液来达到目的[4]。本研究以银杏叶聚戊烯醇为原料，以非离子表面活性剂Span-80和Tween-80作为混合乳化剂，采用反相乳化(EIP)法[5]，制备聚戊烯醇的水包油型纳米乳液，并利用单因素考察和响应面法对制备工艺条件进行优化。

1 实 验

1.1 材料

银杏叶聚戊烯醇同系物[6](聚戊烯醇含碳C70～C120，HPLC外标法纯度95%以上)。Span-80和Tween-80均为分析纯。

1.2 仪器

ZLE-B300型均质乳化剂； XD-202型光学显微镜； Mastersize2000型激光粒度仪； TG1650-WS型高速离心机。

1.3 实验方法

称取银杏叶聚戊烯醇10 g(约8.3 mmol)于250 mL锥形瓶中，边搅拌边加入一定比例的乳化剂(Tween-80和Span-80)，充分搅拌后，缓慢加入少量去离子水，充分混合后继续加水转相至100 mL，充分搅拌后，升温到预定温度，用均质乳化机搅拌一定时间，即可得到聚戊烯醇纳米乳液。

1.3.1 单因素试验 影响聚戊烯醇纳米乳液形成主要有5个因素[4,7]：乳化剂的亲水疏水平衡(HLB)值的选择(8～12)、乳化剂与聚戊烯醇的比例m(乳化剂) ∶m(聚戊烯醇)=(1～2) ∶1(g ∶g)、搅拌速度(5 000～20 000 r/min)、乳化温度(30～90 ℃)、搅拌时间(5～30 min)。分别对上述5个因素进行单因素试验比较，并通过对所得乳液的粒径分布情况分别得出各自最优条件。

1.3.2 纳米乳液粒径分布测定 取5 mL新配置的聚戊烯醇乳液，将乳液用去离子水稀释，利用激光粒度仪对制得的乳液进行粒径分析，测定范围在0.1～5 000 nm。

1.3.3 响应面法组合设计 用响应面法组合设计考察搅拌时间、乳化温度和搅拌速度对聚戊烯醇纳米乳液的影响，在此基础上，研究各因素交互作用对聚戊烯醇纳米乳液的影响，采用中心组合设计，以这3个独立变量为考察因素，利用 Design-Expert 7.0 软件进行Box-Behnken 响应面设计，建立响应值与影响因素间的数学模型。

1.3.4 纳米乳液稳定性及分散性测定 离心稳定性的测定：按GB 11543—1989[8]，取10 mL乳液置于离心管中，用高速离心机在4 000 r/m转速下离心10 min，观察其有无分层情况。离心稳定性分为6个等级，1级最好，6级最差。

分散性的测定：按GB 11543—1989[8]，将乳液滴入水中，观察分散后的溶液状态来鉴定分散性的好坏。分散性分为5个等级，1级最好，5级最差。

贮藏稳定性的测定：按GB 11543—1989[8]，将乳液放置于密封的容器中，室温贮存15 d，观察其有无分层情况。贮藏稳定性分为5个等级，1级最好，5级最差。

冻融稳定性的测定[9]：将乳液装入100 mL塑料瓶中，在(-20±1) ℃ 条件下冷冻24 h，30 ℃的条件下解冻5 h后完成一次冻融循环，测定每次冻融后乳液的离心稳定性以及分散性。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

乳液平均粒径越小，乳液就越稳定，越不容易出现分层、絮凝、聚结等现象，因此将聚戊烯醇纳米乳液平均粒径作为指标对不同影响因素进行考察[10]。选择对聚戊烯醇纳米乳液平均粒径具有影响的5个因素：乳化剂的HLB值、乳化剂与聚戊烯醇的比例m(乳化剂) ∶m(聚戊烯醇)、搅拌速度、乳化温度和搅拌时间，并对复配得到的乳液进行粒径分析。

2.1.1 乳化剂HLB值的选择 乳化剂HLB值定义式为：HLB混合=HLBa×Wa/(Wa+Wb)+HLBb×Wb/(Wa+Wb)，式中：Wa—Span-80的质量分数，HLBa—Span-80的HLB值，Wb—Tween-80的质量分数，HLBb—Tween-80的HLB值。

聚戊烯醇10 g，乳化剂20 g，搅拌速度10 000 r/min，乳化温度60 ℃，搅拌时间10 min，考察复配型乳化剂的HLB值(8～12)对乳液粒径大小的影响。乳化完毕后各自取出10 mL乳液，冷却至室温，放入离心机中以4 000 r/min离心分离10 min，观察分层情况。

表1 乳化剂的HLB值对聚戊烯醇纳米乳液离心稳定性和平均粒径的影响

如表1所示，当乳化剂HLB值在8.5～11.5范围时，所得聚戊烯醇纳米乳液相对稳定。将乳化剂HLB值在8.5～11.5范围的乳液进行粒径分析，结果如表1。结果显示，HLB值在9.5时乳液的平均粒径最小，从而确定HLB值9.5为最佳值。此时Span-80占51.4%； Tween-80占48.6%。

2.1.2 乳化剂与聚戊烯醇比例的选择 聚戊烯醇10 g，乳化剂HLB值9.5，搅拌速度10 000 r/min，乳化温度60 ℃，搅拌时间10 min，考察复配型乳化剂与聚戊烯醇的比例m(乳化剂) ∶m(聚戊烯醇)=(1～2) ∶1对乳液粒径大小的影响。将所得乳液进行粒径

表2 不同条件对聚戊烯醇纳米乳液平均粒径的影响

分析，结果如表2。

结果显示，乳化剂与聚戊烯醇比例在1.75 ∶1时乳液的平均粒径最小，从而确定乳化剂与聚戊烯醇比例1.75∶1为最佳值。

2.1.3 搅拌速度的选择 聚戊烯醇10 g，乳化剂HLB值9.5，乳化剂20 g，乳化温度60 ℃，搅拌时间10 min，考察搅拌速度对乳液粒径大小的影响。将所得乳液进行粒径分析，结果如表2。

结果显示，搅拌速度在15 000 r/min和20 000 r/min时乳液的平均粒径较为接近，考虑到实际操作的经济性，确定搅拌速度15 000 r/min时为最佳值。

2.1.4 乳化温度的选择 聚戊烯醇10 g，乳化剂HLB值9.5，乳化剂20 g，搅拌速度10 000 r/min，搅拌时间10 min，考察乳化温度对乳液粒径大小的影响。将所得乳液进行粒径分析，结果如表2。结果显示，乳化温度在60 ℃时乳液的平均粒径最小，确定乳化温度60 ℃时为最佳值。

2.1.5 搅拌时间的选择 聚戊烯醇10 g，乳化剂20 g，乳化剂HLB值9.5，转速10 000 r/min，乳化温度60 ℃，考察搅拌时间对乳液粒径大小的影响。将所得乳液进行粒径分析，结果如表2。结果显示，搅拌时间在10 min时乳液的平均粒径最小，确定搅拌时间10 min为最佳值。

2.2 响应面分析优化试验及分析

2.2.1 响应面试验结果及分析 由于乳化剂的HLB值和乳化剂与聚戊烯醇的比例这两个因素是与聚戊烯醇的物理性质有关，即是由聚戊烯醇化合物自身的油水分配系数决定，故不作为响应面的考察因素。因此，选取搅拌时间(X1)、乳化温度(X2)和搅拌速度(X3)3个因素，以平均粒径(Y)作为响应值。运用Design Expert 7.0 中Box-Behnken法进行3因素3水平的响应面分析，试验设计及结果见表

表3 Box-Behnken法响应面优化方案及结果

3,方差分析结果见表4。

从表4可以看出，在一次项中，搅拌速度(X3)对聚戊烯醇纳米乳液的平均粒径影响达到极显著水平(P<0.01)，在二次项中乳化时间(X1)和搅拌速度(X3)对乳液平均粒径影响均为显著(P<0.05)，其中搅拌速度(X3)的影响达到极显著水平；交互项中，乳化温度(X2)和搅拌速度(X3)对乳液平均粒径的影响较为显著(P<0.01)。综上所述，各因素对聚戊烯醇纳米乳液平均粒径的影响复杂，受多方面的影响，并非简单的线性关系。各项因素对聚戊烯醇纳米乳液的影响经回归拟合后得到二次多项回归模型为：Y=118.6-28.12X1+4.88X2-82.25X3-0.50X1X2+16.25X1X3-24.25X2X3+16.20X12+8.20X22+72.95X32。该模型P<0.001，表明方程达到极显著，模型能够用于真实实验数据的预测；根据回归模型方程3个因素前的拟合系数绝对值大小82.25>28.12>4.88可知，3个考察因素对聚戊烯醇纳米乳液平均粒径的影响大小依次为搅拌速度(X3)>搅拌时间(X1)>乳化温度(X2)。

表4 回归模型的方差分析

由图1可见，在3个交互项中，交互项X2X3存在较为显著的交互作用，表现为响应曲面的等高线图呈椭圆状，这说明乳化温度(X2)与搅拌速度(X3)这两个因素存在相互影响，即当选用较高的乳化温度时相应的搅拌速度可以降低；反之，当乳化温度比较低时，乳液平均粒径受到搅拌速度不足的制约，可以相应提高搅拌速度以达到乳化目的。交互项X1X3的等高线形状也趋向于椭圆状，但交互作用较X2X3小；交互项X1X2的等高线形状偏向于圆形，表明搅拌时间(X1)与乳化温度(X2)这两项的交互作用并不显著，说明这两者相互作用对聚戊烯醇纳米乳液平均粒径的影响较小。上述分析与模型回归的方差分析基本一致。

图1 各因素交互作用对聚戊烯醇纳米乳液平均粒径的影响

2.2.2 优化与验证实验 通过上述回归模型分析并计算得到聚戊烯醇纳米乳液制备的最佳工艺条件为：搅拌时间12.210 min，温度59.910 ℃，转速16 679.850 r/min。考虑到实际实验和生产的可操作性，将以上最优参数分别调整为搅拌时间12 min，乳化温度60℃，搅拌速度17 000 r/min。并在此条件下进行结果验证，平行测定3次所得聚戊烯醇纳米乳液的平均粒径为97 nm，与模型模拟值(92 nm)的RSD为2.7%(<5%)，此时的粒径分布系数为0.383，说明该模型模拟得到的最佳工艺参数对实际操作的预测较为可靠，具有一定的指导意义。

2.3 纳米乳液分散性及稳定性测定

对优化后制备的纳米乳液进行了离心稳定性、贮藏稳定性及分散性测定，结果均为1级，即乳液呈

表5 优化后聚戊烯醇纳米乳液的冻融稳定性质量检验1)

1)1级表示良好均匀性，2级表示初现稠度不均 1-level showed good

uniformity.2-level showed preliminary visible uniformity is not good.

现出良好的均匀性。冻融稳定性测试结果见表5，结果显示，聚戊烯醇纳米乳液在经过多次循环冷冻后分散仍能保持良好均匀性，达到1级；但是冻融后离心稳定性测试结果显示，在经过1次循环冷冻后，乳液会初现稠度不均的情况，即2级水平，但循环冷冻2～5次均不见乳液稳定性继续变坏现象。聚戊烯醇乳液冷冻后离心出现轻微不均现象，可能与聚戊烯醇分子质量较大，且分子质量分布存在一定差异，以及聚戊烯醇的熔点等物理性质有关[11-12]。

聚戊烯醇纳米乳液的制备工艺及其性能研究，为更好的开展银杏叶聚戊烯醇生物活性以及相关制剂研究工作奠定理论基础，继而全面促进银杏叶有效成分的综合利用。

3 结 论

以银杏叶聚戊烯醇为原料，以非离子表面活性剂Span-80和Tween-80作为混合乳化剂，采用反相乳化(EIP)法，制备聚戊烯醇的水包油型纳米乳液，分别对影响聚戊烯醇纳米乳液性能的乳化剂的HLB值、乳化剂与聚戊烯醇的比例、搅拌时间、乳化温度和搅拌速度等因素进行单因素考察，并对搅拌时间、乳化温度和搅拌速度进行3因素3水平的Box-Behnken响应面分析，所得的结论如下：

3.1 单因素试验结果显示：乳化剂的HLB值为9.5，乳化剂与聚戊烯醇比例为1.75 ∶1，搅拌速度为15 000 r/min，乳化温度为60 ℃以及搅拌时间为10 min。

3.2 建立了以聚戊烯醇纳米乳液的平均粒径为响应值的数学模型：Y=118.6-28.12X1+4.88X2-82.25X3-0.50X1X2+16.25X1X3-24.25X2X3+16.20X12+8.20X22+72.95X32，模型回归方程显著，可用于实际预测。

3.3 通过响应面法优化聚戊烯醇纳米乳液制备工艺参数，结果显示：当乳化剂HLB值为9.5，乳化剂与聚戊烯醇质量比为1.75 ∶1，搅拌时间为12 min，乳化温度为60 ℃以及搅拌速度为17 000 r/min时，聚戊烯醇纳米乳液平均粒径最小，平均粒径为97 nm，与模型模拟值(92 nm)的RSD为2.7%(<5%)，粒径分布系数为0.383，说明该模型模拟得到的最佳工艺参数对实际操作的指导较为可靠，具有一定的指导意义。优化后的聚戊烯醇纳米乳液的离心稳定性、贮藏稳定性、分散性以及冻融后分散性均达到1级，乳液呈现出良好的均匀性；而1次循环冻融后离心乳液会初现稠度不均的情况，即2级水平，并保持该状态。

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Preparation of Polyprenols Nanoemulsion fromGinkgobilobaL.Leaves Polyprenols

TAO Ran1,2,WANG Cheng-zhang1,2,ZHANG Yu-si2,YE Jian-zhong2,ZHOU Hao1,2,CHEN Hong-xia2

(1.Research Institute of Forestry New Technology,CAF, Beijing 100091， China; 2.Institute of Chemical Industry of Forest Products,CAF；National Engineering Lab.for Biomass Chemical Utilization；Key and Open Lab.of Forest Chemical Engineering,SFA；Key Lab.of Biomass Energy and Material,Jiangsu Province，Nanjing 210042， China； )

The preparation of oil-in-water type polyprenols nanoemulsion fromGinkgobilobaL.leaves polyprenols with inversed phase emulsification(EIP) method was studied.On the basis of single factor,the effects of factors,such as hydrophile-lipophile balance(HLB) number,proportion of emulsifier to polyprenol,mixing time,emulsionizing temperature,and mixing rate,on the preparation process and average diameter of polyprenols nanoemulsion were investigated.The preparation conditions,i.e.,mixing time,emulsionizing temperature,and mixing rate,were also optimized by using response surface method (RSM).Results showed that the optimum conditions were mixing time 12 min,emulsionizing temperature 60 ℃,and mixing rate 17 000 r/min.Under these conditions,the average diameter of polyprenols nanoemulsion was the minimum and the RSD of the actual value (97 nm) with the fitted value (92 nm) was 2.7%(<5%),and the distribution coefficient of particle diameters was 0.383.The optimal parameters obtained by simulating this model were reliable in predicting the actual operation,and had certain guiding significance.The centrifugal stability,storage stability,diepersity,and freezing-thawing dispersity of polyprenol nanoemulsion under the optimum conditions showed good uniformity and reached 1-level.The freezing-thawing centrifugation stability of polyprenol nanoemulsion showed preliminary visible uniformity,which was 2-level,and kept 2-level.

GinkgobilobaL.；polyprenols；nanoemulsion；response surface method

10.3969/j.issn.1673-5854.2015.01.002

2014- 08- 14

中国林科院林业新技术所基本科研业务费专项资金(CAFINT2014C10)；国家国际科技合作专项项目(2014DFR31300)；江苏省林业三新工程项目(LYSX[2014]09) 作者简介：陶 冉(1982—)，男，江苏连云港人，博士，主要从事天然产物化学研究；E-mail:trmoon1949@163.com

TQ35

A

1673-5854(2015)01- 0007- 06

*通讯作者：王成章(1966—)，男，湖北汉川人，研究员，博士，博士生导师，主要从事天然产物研究与利用；E-mail:wangczlhs@sina.com。