基于核磁共振的中、长跑运动员大负荷训练课30 min后尿液代谢组学特征的研究

马海峰，吴 瑛



基于核磁共振的中、长跑运动员大负荷训练课30 min后尿液代谢组学特征的研究

马海峰，吴 瑛

目的：基于核磁共振(NMR)代谢组学的手段，研究一堂中、长跑运动员大负荷训练课30 min后的代谢组学特征。方法：选取14名上海市田径队中、长跑组男运动员为研究对象。训练内容包括：1)专项耐力:8 000 m、休息20 min；2)专项速度耐力：(500 m快跑+100 m慢跑)×16次，分为两组(12+4),两组间隔6 min。训练前和训练后30 min采尿样。所有NMR实验均在298 K温度下，在带有超低温探头的600 MHz brokerAvance III HD的核磁共振谱仪上进行。采集尿液样品的1H NMR谱，用MestReNova V8.1.4对所有一维1H NMR谱进行处理,归一化处理后的数据输入SIMCA-P+12.0软件包中，进行中心化标度化处理，进行主成分分析(PCA)，最小二乘法-判别式分析(PLS-DA)和正交最小二乘法-判别式分析(OPLS-DA)。结果：训练前、后尿液样本有明显的区分。对训练前、后尿液样本区分有贡献的代谢物主要有：训练后尿液中乳酸、甘氨酸和N-氧化三甲基胺有明显的上升，肌酐含量下降。去除乳酸和肌酐后，载荷图显示，训练后，丁酸、亮氨酸、异丁酸、乳酸、琥珀酸、次黄嘌呤、2-羟基丁酸、 2-羟基正戊酸的含量上升；丙酮酸、谷氨酰胺、柠檬酸、甲酸脂和甘氨酸的含量下降。 结论：本次训练课呈现出无氧、有氧以及混氧代谢的特点，符合现代中、长跑运动比赛的特点，达到了本次训练课的目的，训练有较好的效果，但也出现了一些较严重的疲劳症状。丁酸、异丁酸浓度在训练后升高，亮氨酸浓度下降有可能是有氧代谢的潜在标志性代谢物。运动后肌酐浓度下降和TMAO浓度上升，可能是大负荷训练造成疲劳的重要潜在生物标志物。

代谢组学；中、长跑；大负荷训练；运动性疲劳；核磁共振

1 前言

运动引起机体物质和能量代谢的变化或适应，且必然在代谢物上有所体现[4]。代谢组学(metabonomics/metabolomics)是20世纪90年代末期发展起来的一门学科，是自人类基因组计划之后，迅速发展起来的以高通量检测和数据处理为手段、以信息建模与系统整合为目标、以群组指标分析为基础的系统生物学学科[31]。代谢组学通过测量体内各种代谢物浓度、比例的变化来反映机体状况的分子集合与其功能之间的关系，客观反映生物体整体变化的特性[17]。代谢组学研究不局限于机体受到各种外界条件影响后某个物质或代谢通路的变化细节，而是关注机体在经历了一系列变化后整体性的代谢产物变化。区别于以往任何一种采用单一或某一方面指标的检测方法，代谢组学研究可以更加准确和全面地反映机体状态的整体性和动态性变化[6]。

因此，采用代谢组学研究运动人体科学问题具有很大的潜力。目前，代谢组学在体育科学领域的应用集中于运动训练方法手段[19,32]、运动饮料补充效果以及时机[17,26]、生理与心理应激[40,48]等方面的研究分析。这些研究认为，代谢组学在人体运动科学领域是一个非常有前途和潜力的工具，它不仅能获得全面的运动员代谢物谱信息，而且，可以系统地监测机体的生理状态并阐明运动引起的机能状态改变，这些信息都是常规手段难以获得的。他们认为，运用代谢组学技术可以从整体上全面系统的研究运动作用于机体后所引起的小分子化合物的代谢变化，寻找与运动有关的生物标志物，也可以通过全面评估不同运动形式、不同运动强度、不同运动时间以及不同运动频率对机体所产生的代谢物组变化来指导科学合理的运动训练；还可以研究与运动密切相关的糖代谢、脂代谢、氨基酸代谢等的整体变化特征模式，进而在代谢组层面上分析运动性疲劳的机理及其恢复途径。

以代谢组学、体育、运动、训练等为关键词在中国知网、维普期刊等平台获得5篇论文，其中，综述1篇，以metabolomics、metabonomics和exercise、physical activity、training为关键词，在pubmed获得11篇文章，其中，包括代谢组学研究运动对病理状态的影响，如对冠心病、间歇性跋行、糖尿病、肥胖大鼠和超重人群等，而运用代谢组学方法研究单纯运动负荷对机体的影响的报告不多，有关急性运动后正常人体的代谢组学特征，仅有3篇报告[19,26,32]。

中、长跑是典型的体能主导类周期性竞速项目，突出特征是高速持续跑的能力，即专项速度、专项耐力、专项速度耐力等多种能力。所以，优秀的中、长跑运动员必须具备良好的有氧、无氧、有氧—无氧混合代谢能力和突出的其他各项竞技能力。中、长跑已经不再是传统观念上的中速耐力型项目，已经成为混氧供能和速度耐力为主的体能类竞速耐力性项目。本研究基于核磁共振(NMR)代谢组学的手段，拟对一堂中、长跑运动员大负荷训练课进行观察，以运动员训练前、后尿样为样本，采集代谢物图谱，结合多变量和单变量统计分析，研究中、长跑运动员大负荷训练后变化明显的代谢物，寻找潜在的关键标志物，探索这一状态下机体代谢通路和调控机制，为预测、诊断运动员状态，评价运动性疲劳恢复的新方法提供参考。

2 研究对象与方法

2.1 研究对象

选取14名上海市田径队中、长跑组男运动员为研究对象。运动员平均年龄17.33±1.58岁，身高173.84±3.04 cm,体重57.57±4.33 kg,体重指数(BMI)17.98±0.73，脂肪指数(FBF)11.24±1.23,最大摄氧量66.06±2.98。其中，健将级运动员5名，一级运动员6名，二级运动员3名。

2.2 训练课内容

时间：2013年12月14日 (周六)上午

专项耐力:8 000 m跑；平均85 s/圈(400 m)；总时间28 min 20 s。最后5圈用时应保持为：90-86-84-82-78(s)，休息20 min。

专项速度耐力：(500 m快跑+100 m慢跑)×16次；分为两组(12+4)：前12次为一组(穿普通运动鞋跑)，后4次为一组(穿钉鞋跑)，两组间隔6 min。第1组强度87-85-84-82-80 s(500 m快跑大概用时)；第2组强度：80-78-75-72 s(500 m快跑大概用时)。

训练课处于全年训练计划准备期的后期，此阶段专项能力的提高是主要任务，在有氧能力的基础上，发展无氧能力，主要提高磷酸盐系统、糖酵解系统和有氧氧化系统的混合供能能力。由于运动员集体住宿，在同一食堂就餐，所以容易做到统一作息时间，相同饮食。取样时间为训练前和训练后30 min采尿样[15,41](图1)。本实验得到实验伦理道德委员会认可。所有运动员都了解本次实验的目的，同意进行实验并遵守有关实验作息、饮食等的要求。

图1 本研究运动员训练内容及采样流程图Figure 1. Design of the Exercise Program and Arrows Indicate Urine Sampling

为了确定比赛的负荷强度和负荷量，本研究检测了运动中的心率(Polars610i遥测心率表，芬兰)和运动员主观体力感觉量表(RPE)(采用研究人员持卷调查的方式)。

2.3 样品收集和1H NMR谱采集

体积为500 μL尿液样本收集在装有20 μL1%(w/v)NaN3的EP管中，存储在-80℃的冰箱中。进行NMR谱采集前，加入磷酸盐重水缓冲液[1.5 M，pH 7.4，含有2.26 mM的2,2,3,3-四氘代-3-三甲基硅丁酸钠(TSP)]，将样品pH值控制在一个较小的范围内，离心(12 000 g，4℃，10 min)后，取上清(500 μL)移入5 mm NMR试管中，D2O锁场，TSP定标(δ0.00)。

采集尿液样品的1H NMR谱时，使用预饱和水峰的NoesyPr1d脉冲序列[RD-90°-t1-90°-tm-90°-ACQ]，混合时间tm为120 ms，前两个90°脉冲之间的t1为6.6 μs。其他参数与组织水溶性萃取液的一维NMR谱相同。128条FID，64 k个数据点，20.48 ppm的谱宽，2.66 s的采样时间(acquisition time，ACQ)，水峰压制是在弛豫延迟时间(recycle delay，RD)4 s内完成。

随机对某些样品采集了二维预饱和水峰脉冲梯度场1H-1H相关谱(COSY)和二维带有水门的1H-1H 总相关谱(TOCSY)，以确认一维氢谱的谱峰归属。所有NMR实验均在298 K温度下，在带有超低温探头的600 MHz brokerAvance III HD的核磁共振谱仪上进行。

2.4 多变量统计分析

为挖掘一维1H NMR谱中的代谢物信息，本研究对所有一维1H NMR谱进行了一系列的处理：1)一维1H NMR谱在进行傅里叶变换前乘上0.3 Hz展宽的窗函数；2)傅里叶变换；3)手动调相；4)基线校正；5)参考TSP(δ 0.00)定标；6)仔细地进行峰对齐操作；7)对尿液的1H NMR谱均以0.003 ppm宽度将δ 9.50～0.50区域划分为3 000个积分区段，以上操作均在软件MestReNova V8.1.4(mestrelab research S.L.)中进行；8)在所有谱图积分数据中去掉δ 5.20～4.70水峰所在的积分位置和δ 6.00～5.20尿素的宽峰信号；9)对剩余的积分数据进行归一化处理以消除样品之间的浓度差异；10)归一化处理后的数据输入SIMCA-P+12.0(Umetrics,Umeå,Sweden)软件包中进行中心化标度化处理；11)进行主成分分析(PCA)，最小二乘法-判别式分析(PLS-DA)和正交最小二乘法-判别式分析(OPLS-DA)。PCA和PLS-DA得分图用第1和第2主成分来展示，OPLS-DA得分图用第1预测主成分和1个正交成分来展示。

根据OPLS-DA模型提取变量的VIP(变量在映射中的重要性)数值，将VIP> 1的变量作为对分组有潜在贡献的代谢物。

在Java环境下计算变量与预测主成分之间的相关系数(r)，根据r大于P=0.05时的临界值标准来确定有显著相关的变量，此变量对分组有显著统计学意义。临界值的确定首先根据公式df=n1+n2-2计算自由度df，其中，n1、n2为OPLS-DA模型中两组各自的样本数，然后根据df值查询相关系数界值表中P=0.05时相关系数的临界值。综上，本研究中对分组有贡献的变量选取方法的标准有2条：VIP>1和|r|>r(临界值P=0.05)

OPLS-DA载荷图用来确定哪些代谢物对分组有贡献，组间代谢物浓度差异的显著性程度通过计算相关系数的绝对值|r|来确定，此值大于P=0.05的r临界值，但小于P=0.01的r临界值，在载荷图上的颜色为黄色；此值大于P=0.01的r临界值，在载荷图上的颜色为红色；值小于P=0.05的r临界值，则颜色为蓝色(图5，图8)。

R2X(cum)、R2Y(cum)和Q2(cum) 3个参数用来检验PCA、PLS-DA、OPLS-DA模型的稳健性，这些参数数值越大，模型越可靠。排列实验图中Q2回归曲线截距是负的，并且所有左边的Q2数值均低于最右边的Q2数值，表明没有过拟合现象发生(图4，图7)。

3 结果

对采集的尿液样品进行NMR谱图分析,观察中、长跑运动员在大负荷训练前、后代谢模式上的差异。对照相关文献和数据库,对特征峰进行指认。NMR—维谱显示，训练前、后运动员尿液中代谢模式区分有重要贡献的代谢物归属于图2。

表1 本研究运动员心率变化一览表Table 1 Changes of Athletes HR

图2 本研究训练前、后运动员尿液一维核磁共振氧谱特征峰的指认图Figure 2. Two Typical 600 MHz 1H NMR NoesyPr1d Spectra (δ 0.6～4.7,6.3～9.4) of Urine Specimens from Pre (A),and Post (B) Exercise

注：(A)表示训练前，(B)表示训练后；对一维氢谱的归属：横坐标是化学位移，单位是ppm,每一个代谢物在相同的缓冲液中，出峰的位置是固定的，即化学位移是固定的。谱峰的峰面积与代谢物的溶度是正相关关系，可以通过对谱峰进行积分进而做定量分析；甲酸脂(formate，For)、次黄嘌呤(hypoxanthine，Hyx)、肌酐(creatinine，Cr)、甘氨酸(glycine，Gly)、N-氧化三甲基胺(N - trimethyl amine oxide，TMAO)、柠檬酸(citrate，Cit)、谷氨酰胺(glutamine ，Gln)、琥珀酸(succinate，Suc)、；丙酮酸(pyruvate，Py)、乳酸(lactate，Lac)、亮氨酸(leucine，Leu)、异丁酸(isobutyrate，IB)、丁酸(butyrate，But)、2-羟基丁酸(2-hydroxybutyrate，2HB)、 2-羟基正戊酸(2-hydroxyisovalerate，2HIV)。

本研究中，PCA、PLS-DA和OPLS-DA样本得分图两组之间均有簇类分布(图3)，OPLS-DA模型的Q2值为0.771，大于0.4，且排列实验表明，最右边的Q2值大于所有左边的Q2值，R2X和R2Y分别为0.945和0.861(图4)。这些结果表明，训练前、后尿液样本有明显的区分。

从图5可以发现，对训练前、后尿液样本区分有贡献的代谢物主要有：训练后尿液中乳酸(Lac)、甘氨酸(Gly)和N-氧化三甲基胺(TMAO)有明显的上升，肌酐(Cr)含量下降。

图3 本研究训练前、后运动员两组样本尿液的多变量统计模型Figure 3. PCA (A),PLS-DA (B),and OPLS-DA (C)Scores Plots of 1H NMR Data of Pre and Post-Exercise Groups

注：主成分分析得分图(A)，偏最小二乘法-监督分析得分图(B)，正交偏最小二乘法-监督分析得分图(C)；TB表示训练前，TA表示训练后。

图4 本研究训练前、后运动员两组样本尿液OPLS-DA可靠程度排列实验图Figure 4. Permutation Tests Derived from PLS-DA Models with the 6-round Cross Validation

注：深黑色的方块所在的位置指示Q2的值，如果深黑色直线最左边的Q2值大于所有右边的Q2值，则说明此OPLS-DA模型是可信的，否则是过拟合的，结果不可信。Q2表征模型的可信程度，一般认为Q2的值大于0.4，可信程度较高，R2X和R2Y表征本模型能够解释的变量的百分数，越高越好。

图5 本研究运动员训练前、后各代谢物OPLS-DA载荷图Figure 5. OPLS-DA Loading Plots of 1H NMR Data from Pre vs.Post-Exercise Group

注：相关系数|r|和VIP(变量在影射中的重要性)是考察哪些代谢物对分组有意义的参数，相关系数|r|大于P为0.05时的临界值和VIP大于1，作为对分组有贡献的代谢物的选择标准。

图6 本研究去除乳酸和肌酐积分值后训练前、后运动员两组样本尿液的多变量统计模型Figure 6. The Scores Plots of PCA (A),PLS-DA (B),and OPLS-DA (C) Derived from 1H NMR Data of Pre and Post-Exercise Groups with the Signals of Lactate were Excluded

注：主成分分析得分图(A)，偏最小二乘法-监督分析得分图(B)，正交偏最小二乘法-监督分析得分图(C)；TB表示训练前，TA表示训练后。

图7 本研究去除乳酸和肌酐积分值后训练前、后运动员两组样本尿液OPLS-DA可靠程度排列实验图Figure 7. Permutation Tests Derived from PLS-DA Models with the 6-Round Cross Validation with the Signals of Lactate were Excluded

因为训练后乳酸和肌酐的含量变化剧烈，将这两个代谢物的积分值略去后，再进行进一步的多变量统计分析，发现训练前、后样本的区分显著。

PCA、PLS-DA和OPLS-DA样本得分图两组之间均有簇类分布(图6)，OPLS-DA模型的Q2值为0.722，大于0.4，且排列实验表明，最右边的Q2值大于所有左边的Q2值，R2X和R2Y分别为0.436和0.85(图7)。这些结果表明，训练前、后尿液样本有明显的区分。

图8 本研究去除乳酸和肌酐后各代谢物OPLS-DA载荷图Figure 8. OPLS-DA Loading Plots of 1H NMR Data from Pre vs.Post-Exercise Group with the Signals of Lactate were Excluded

由去除乳酸和肌酐后载荷图发现，训练后，丁酸(But)、亮氨酸(Leu)、异丁酸(IB)、乳酸(Lac)、琥珀酸(Suc)、次黄嘌呤(Hyx)、2-羟基丁酸(2HB)、 2-羟基正戊酸(2HIV)的含量上升；丙酮酸(Pyr)、谷氨酰胺(Gln)、柠檬酸Cit)、甲酸脂(For)和甘氨酸(Gly)的含量下降。这些代谢物涉及到能量代谢和氧化应激等代谢途径。

4 讨论

现代中、长跑训练以混和代谢为主，有氧代谢为辅，并注重无氧代谢能力的发展。中、长跑训练时，内容负荷的安排会在巩固有氧代谢的基础上，着眼于混氧代谢能力的发展。有研究指出，中、长跑训练要高度重视运动员的无氧、高强度混氧与低强度混氧的跑量。增加中等以上强度和大强度的训练量，提高运动员机体的快速供能能力，保证训练质量是当今中、长跑运动训练负荷的一个突出特点[11]。胡泓等[3]提出，中、长跑训练不是仅仅发展有氧代谢，还要大量从事无氧代谢、混氧代谢方面的训练。本研究中的训练课就是以这种训练理念为基础，在训练课内容第1部分以持续训练法发展有氧耐力的基础上，第2部分以间歇变速跑手段，加强运动员有氧和无氧混合供能的能力。

在传统的运动生化测试中，一次训练课的负荷常采用血乳酸、血尿素等指标，有时也采用尿蛋白、磷酸肌酸激酶和心率等辅助指标[7]。代谢组学技术与过去的生化检测方法相比，能更加全面和敏感地反映人体代谢模式的变化，在运动人体科学中具有很明显的方法学优势和应用前景[4,13]。基于核磁共振 (NMR)的代谢组学技术能够量化所有小分子代谢物，从而全面监测机体对各种刺激反应的波动[22,33,49]。而且，传统的运动生物化学方法主要采用血液为样本，对尿液中物质含量进行测定相对较少[41]。而代谢组学研究却经常采用尿液作为代谢样本，Wallner-Liebmann等[45]认为，尿液既植入了非常多的日常生活的信号，也有着非常清晰的代谢组学信号，甚至已经初步建立了一个基于尿液代谢组学的检测标准，以观察药物、生活方式、膳食补充剂以及疾病对人体代谢信号的影响。在运动人体科学的研究中，尿液作为样本也有着非常大的实践意义。尿液是机体代谢的终端，能反映出体内所有生物调节过程。尽管尿液中物质的排泄与肾脏调节支配有一定联系[29]，但尿液中代谢物的浓度还是在很大程度上与血液中代谢物浓度高度相关。最关键的是，尿液采集是无创的方法，对运动员和教练员来说更容易接受，对采集者来说具有更大的便利性和很强的可操作性。

本研究基于NMR代谢组学的手段，对上海市中、长跑运动员一堂大负荷训练课进行观察，训练课处于全年训练计划准备期的后期，此阶段专项能力的提高是主要任务，在有氧能力的基础上，发展无氧能力，主要提高磷酸盐系统、糖酵解系统和有氧氧化系统的混合供能能力。预期在尿样代谢物分析中，应能发现ATP再合成、糖、蛋白质、脂肪等能源物质以无氧、有氧代谢混合供能方式存在的证据。

心率(HR)是每分钟心脏搏动的次数，是训练监控的常用生理指标。心率随运动员运动强度的加大而加快，可反映运动强度和机体的代谢水平。运动员运动时心率，分为极限负荷心率(心率达到185次/min 以上)、次极限负荷心率(170次/min 左右)和一般负荷心率(150次/min 左右)。在运动中常用心率控制有氧运动的强度和间歇训练的间歇时间，评定训练课的生理负荷量、运动员训练程度、机能状态及心储备功能等[10]。本次训练课的14名运动员平均HR为168±2.9次/min，最高心率达到202±3.1次/min(表1)，反映本次训练强度和量都很大,总负荷值达到大负荷程度。RPE调查结果显示，所有运动员在训练后，主观体力感觉都达到了非常疲劳的程度。

通过代谢组学检测发现，运动员运动后与运动前尿样具有明显不同的代谢组学图谱(图2)。对训练前、后尿液样本区分有较大贡献的代谢物主要有：训练后尿液中乳酸、甘氨酸和N-氧化三甲基胺有明显的上升，肌酐含量下降。在排除乳酸和肌酐的信号后(Enea[19]的研究排除了尿素、肌酐和乳酸信号；Pechlivanis等[32]的研究排除了乳酸信号)，载荷图显示，训练后，丁酸、亮氨酸、异丁酸、琥珀酸、次黄嘌呤的含量上升；丙酮酸、谷氨酰胺、柠檬酸、甲酸酯含量下降，这些代谢物涉及到氨基酸代谢、能量代谢和氧化应激等代谢途径。和其他有关单纯运动因素导致的代谢物变化的研究[5,19,32]相比，本研究结果和他们大体一致并有着本次训练课自己的特点。

4.1 磷酸原系统

磷酸肌酸和肌酸是再合成ATP的最快能量储备，能够反映机体短时间快速供能能力。肌酐是体内磷酸肌酸或肌酸的代谢产物，磷酸肌酸和肌酸在人体内组成肌酸池，是能量利用和储存的重要物质。人体内大约95%的肌酸池存在于骨骼肌中，在骨骼肌中，磷酸肌酸约占总肌酸池的2/3。磷酸肌酸在分解过程中，可脱去1分子磷酸转变成肌酐，肌酸也可脱水转变成肌酐。人体在正常状态下肌酐水平的升高暗示着肾功能紊乱并伴随着心血管疾病的危险[43]。大运动量训练后，血清肌酐浓度稍有上升，运动引起的血清和尿液中肌酐浓度的增高，反映了肌细胞内肌酸的释放和循环的加强。尿肌酐在运动员机能评定中常被作为速度、力量素质的选材、训练效果等检测指标，其数值高是肌肉机能好的反映。反之，可能是肌肉机能下降的表现[2]。Enea[19]、Pechlivanis等[32]和黄彩华[5]的研究发现，大强度短时间训练或比赛后，代谢物中肌酐含量上升，可能是他们所采用的短时高强度的运动负荷，会反射性地加强肌细胞释放肌酸的能力。本研究中肌酐含量在运动后出现下降趋势，推断是由于训练课中这种持续时间较长，采用组间休息时间较短的间歇训练法的大负荷训练课导致了运动员肌酸池储能下降，肌肉机能下降。虽然尿肌酐的排出量主要与肌肉质量和磷酸肌酸含量有关，不受训练强度和负荷量的影响，但本研究认为，肌酐含量在运动后下降可能是大负荷训练造成疲劳的标志之一。

4.2 无氧酵解系统

在短时间大强度运动时,大约80%的能量来自机体的无氧代谢和糖酵解代谢[36,39]，主要表现在嘌呤分解代谢的活跃和乳酸的产生[24]。次黄嘌呤升高提示运动员体内核苷酸分解代谢提供能量过程加强，也可能提示是细胞内处于缺氧和氧化应激状态。递增负荷引起机体的氧化应激在多个研究中已经被观察到[16,37,44]。次黄嘌呤(Hypoxanthine)也称“6-羟基嘌呤”，是一种天然存在的嘌呤衍生物。它的核苷酸肌苷酸是核酸的嘌呤核苷酸的合成前体。在核苷酸合成中，次黄嘌呤在次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的作用下，转变为肌苷酸(IMP)。在恢复期间,大部分的IMP可迅速再合成为ATP,且一小部分进一步分解,导致次黄嘌呤的产生[42,47]。研究发现，通过对机体血样次黄嘌呤变化的观察可以监测有机体细胞内的能量代谢情况。还有研究指出，次黄嘌呤是形成超氧自由基的酶促反应底物，被认为是组织缺氧的标志[20]。本研究结果与另外的急性运动的代谢组学研究结果一致[19,25]，提示，本次训练课过程中，运动员机体处于缺氧和氧化应激状态。

人体的这种缺氧和氧化应激状态会引起乳酸增加。当人处于缺氧或剧烈运动时，细胞供氧不足，线粒体内丙酮酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的氧化分解过程受抑制，从而导致丙酮酸和NADH在细胞质基质中大量积累，加快了乳酸的生成。乳酸是人体代谢过程中的一种重要中间产物，它与糖代谢、脂类代谢、蛋白质代谢以及细胞内的能量代谢关系密切。乳酸源于葡萄糖和糖元的酵解过程。运动时，随着细胞内ATP和CP的消耗，细胞质内的ADP、AMP、Pi和肌酸大大增加，激活了细胞内的糖分解过程，产生大量的丙酮酸和NADH，而且，其生成速率远远超过线粒体内的氧化速率，因此，丙酮酸和NADH在细胞质基质中大量积累，导致细胞内产生较多的乳酸。虽然很少有常规的实验报告提及尿中乳酸指标可以反映运动机能[29]，但Pechlivanis等[32]同时用传统的方法在实验中测得乳酸和肌酐浓度比值，发现和1H NMR测试结果高度相关，也证实了1H NMR测试的有效性。本实验和其他3个类似实验[5,19,32]都出现了运动后代谢物中乳酸大量增加的现象，提示本次实验的训练课中运动员糖酵解系统供能的证据。而琥珀酸这种厌氧代谢的发酵产物之一在训练后浓度上升也说明了这一现象。

4.3 有氧氧化系统

脂肪酸在有充足氧供给的情况下，可氧化分解为CO2和H2O，释放大量能量，因此，脂肪酸是机体主要能量来源之一。在长时间、大负荷训练状态下，血浆游离脂肪酸浓度升高，以便各组织细胞摄取后氧化供能。此外，脂肪酸不完全氧化生成的酮体可以作为能源，提供给骨骼肌和脑部神经系统氧化利用。酮体是脂肪酸在肝脏进行正常分解代谢所生成的特殊中间产物，包括有乙酰乙酸(约占30%)、2-羟基丁酸(2HB) (约占70%)和极少量的丙酮[1]。正常人血液中酮体含量极少，这是人体利用脂肪氧化供能的正常现象。人体持续运动到一定时间时，为补偿糖代谢的不足，有机体通过促进脂肪氧化来满足运动系统的需要。本实验中，2HB等酮体生成明显增加，另外，脂肪酸代谢的产物也明显升高，短链脂肪酸 (SCFAs)(丁酸、异丁酸)等浓度均明显升高。SCFAs是最重要的在远端肠道发酵的最终产品和间接营养身体的物质。丁酸盐是肠道能量的主要来源[34]。丁酸盐在肠道内的氧化供应超过70%的能量，从而减少葡萄糖氧化和储备谷氨酰胺和丙酮酸[23]。丁酸在细胞线粒体中通过b-氧化通路代谢，然后进入柠檬酸作为乙酰辅酶a，和草酰乙酸一起，通过柠檬酸合成酶共同生成柠檬酸。柠檬酸可以进一步在柠檬酸循环代谢的电子传递链生成电子，推动ATP生成[23,46]。本研究中，柠檬酸等有氧代谢的中间产物浓度也显著升高,提示，运动员有氧代谢活动增强；糖和脂肪酸的有氧氧化分解在本次训练课能量代谢中发挥重要作用。

在Pechlivanis等[32]的研究中，即使是短时间的运动，也有酮体的变化，但有关脂肪酸代谢的产物均没有变化，如丁酸、异丁酸等浓度。而黄彩华[5]的研究中，即使是号称有氧代谢占优势的花剑比赛，脂肪酸代谢产物也没有变化。可能酮体是脂肪酸不完全氧化的产物，在缺氧的情况下也会生成。而丁酸、异丁酸是脂肪酸在氧充足环境中产生，提示丁酸、异丁酸有可能是有氧代谢的潜在标志性代谢物。

4.4 氨基酸和支链氨基酸

氨基酸(Amino acid)是构成蛋白质的基本单位，内环境中的氨基酸,一部分进行蛋白质的再合成，一部分转化为嘌呤等含氮化合物,或脱羧基转化为胺类,其余的则脱氨基进入氧化代谢。因此,嘌呤、胺类、在血中的浓度也会随之升高[9]。有研究认为，力量性运动员在经过各种形式的训练后10 min，除少数氨基酸因为转氨基、三羧酸循环中间产物再合成而含量升高之外，大部分血清氨基酸含量都是下降的[35]。谷氨酰胺(Gln)是最常见的20多种氨基酸中的一种，是肌肉中最丰富的游离氨基酸，约占人体游离氨基酸总量的60%。谷氨酰胺不是必需氨基酸，在人体内可由谷氨酸、缬氨酸、异亮氨酸合成。免疫细胞的增殖和保持正常功能都高度依赖谷氨酰胺[14]。高强度的训练会干扰免疫系统，增加体内乳酸及铵的水平。高水平的铵会影响肌肉功能。谷氨酰胺可以调节肌肉内血氨的水平，缓冲乳酸，降低氨和乳酸对细胞的不良影响；在训练开始5 min内，谷氨酰胺水平会上升，释放分解激素，训练中肌肉继续释放谷氨酰胺，导致其水平下降。训练强度越高，谷氨酰胺流失速度越快。血浆谷氨酰胺水平可作为过度训练的一个重要指标。在进行高强度力量训练时，体内谷氨酰胺的水平有可能下降达50%。此时，若不能通过饮食或自身合成得到补充，肌肉蛋白就会发生分解，以满足机体对谷氨酰胺的需求。这种现象既会影响肌肉的体积，也会由于免疫系统的谷氨酰胺主要来源于骨骼肌的释放，从而导致机体的免疫力降低。长时间、力竭性运动后，血浆谷氨酰胺水平更低，有的人可能维持低水平达几周、几个月甚至数年之久。本研究训练采用的负荷性质也是这种长时间、力竭性运动，其谷氨酰胺水平显著下降，研究提示，大负荷训练对体内能量储备有着巨大的需求，导致了血浆中谷氨酰胺浓度的降低，可能引起肌肉缩小、肌肉损耗、细胞脱水和肌肉萎缩等不利于运动能力提高的症状。

与此不同，甘氨酸浓度在训练后显著上升。甘氨酸(Gly)是最简单的氨基酸，又名氨基乙酸，参与嘌呤类、卟啉类、肌酸和乙醛酸的合成，可与多种物质结合，由胆汁或从尿中排出。在医药方面，甘氨酸单独使用可治疗重症肌无力等营养失调症，促进脂肪代谢；丙氨酸的增加,琥珀酸的减少和甘氨酸的消费被视为能源生产和核苷酸从头合成的信号[21]。刘靖等[8]通过观察甘氨酸对正常饮食和高脂饮食小鼠体重及血脂代谢的影响研究发现，Gly对正常饮食和高脂饮食的小鼠都有降低体重和体脂含量的作用,并能降低血脂。王磊等[9]在优秀游泳运动员冬训的代谢组检测中，甘氨酸明显升高。左群等[28]利用HPLC法测试大鼠一次性90 min持续下坡跑，发现运动后1 h内血清与骨骼肌中甘氨酸呈上升趋势。但是，短时、大强度的急性运动导致的代谢物中甘氨酸浓度都呈下降或不变趋势[19,32]。只有以长时间有氧代谢为主要供能方式的花剑比赛呈现和本研究同样的结果[5]，提示，甘氨酸浓度上升可能是机体脂肪代谢供能比例上升的标志。

4.5 N-氧化三甲基胺(N - trimethyl amine oxide ，TMAO)

目前，研究N-氧化三甲基胺(TMAO)在人体中的生物学作用的文章较少[27]。自从出现了代谢组学分析，TMAO才被研究者们从大量的代谢物中筛选出来，并引起高度关注。在临床研究中，TMAO是缺血性肾损伤的生物标示物，其浓度变化常常与肾功能损伤和肠道菌群紊乱联系在一起。研究证实，肠道菌群在人类形成TMAO过程中必不可少，而且，TMAO水平与将来心脏病发作、卒中和死亡之间有一定关系，即使在确定的无心脏病风险者中依然如此[12]。最近的一项研究表明，肠道菌群的细胞转录是依赖TMAO做为磷酸化开关，选择有氧氧化和厌氧作用[18,27]。

研究显示，在体内pH下降和温度升高时，TMAO降解速度加快[30]。运动时体内酸性物质大量积累，温度升高，可能是运动时TMAO下降的重要原因。但本研究中，TMAO有明显的上升，原因可能和运动员运动时间和负荷的大小有关。对比其他有关急性运动对代谢组学的影响的研究，TMAO的浓度都是无变化和下降[19,32]，本研究认为，这是因为他们所采用的负荷量度都比较小，而本次训练课运动员最高心率达到202±3.1次/min，RPE疲劳量表中运动员疲劳程度也较大。虽然机制尚不明确，但由于TMAO对本实验运动前、后分组的贡献很大，本研究认为，TMAO很可能是运动过程中代谢调节的重要生物标志物，提示，TMAO 可以作为一个急性运动性疲劳的潜在标志性代谢物。

另外，美国克里夫兰诊所(Cleveland Clinic in Ohio)的斯坦利·哈森(Stanley Hazen)研究认为，吃红肉和蛋白质较多的人，肠内细菌合成TMAO的效率也高一些，提示，高蛋白饮食在中、长跑训练和比赛中TMAO生成效率变高，可能导致疲劳更早出现和程度加深，正应了教练员们对赛前饮食的一句俗话“吃蛋得蛋”，体内TMAO水平高可能是这种现象的机制之一。

虽然，本研究基于NMR的代谢组学检测，发现中、长跑运动员一堂大负荷训练课后30 min的一些代谢特征和潜在的关键标示物，但由于与本研究相关的报告很少，能够借鉴和比较的案例不足以区分类似本次训练课的特点，因此，以后应在此基础上进行更多的实验以证实这些标志物。

5 结论

1.中、长跑运动员一次大负荷训练前、后尿液样本的NMR代谢谱存在差异，可从代谢组学分析中找出特异的标志性代谢产物。

2.基于NMR运动员尿液代谢组学的评价，本次训练课后30 min运动员机体呈现出无氧、有氧以及混氧代谢的特点，符合现代中、长跑运动比赛的特点，达到了本次训练课的目的，训练有较好的效果，但也出现了一些较严重的疲劳症状。

3.和无氧代谢占较大比例的短时、大强度运动负荷相比，本次训练课后30 min运动员尿液代谢物中和有氧代谢相关的丁酸、异丁酸浓度升高，丁酸、异丁酸有可能是类似本次训练课这种混氧能力训练的标志性代谢物。

4.N-氧化三甲胺(TMAO)是大负荷训练代谢调节中重要的生物标志物，未来可以开发为敏感的、特异的运动性疲劳的监控指标，其涉及的调节通路可能为运动营养补剂的研发提供新的靶点。

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1H NMR-Based Metabonomic Investigation of the Characteristic of Human Urine 30 min after a Heavy Load Training Class on the Middle & Long-distance Race Athletes

MA Hai-feng,WU Ying

Objective:This paper,basing on the means of nuclear magnetic resonance (NMR),studied a middle&long-distance race athletes metabonomics characteristic 30min after a class of heavy load training.Methods:14 male athletes from Shanghai athletic team were chosen as subjects.The training class included:A special endurance:8 000m;B special speed-endurance(500m faster+100m slower)*16.The urine samples were collected before and after 30min from training.Aliquots of urine sample were thawed for metabonomic analysis through1H NMR spectroscopy.All NMR experiments were carried out at 300K on a Bruker (Karlsruhe,Germany) Avance III 600 MHz spectrometer equipped with an ultra-low temperature probe.The FIDs processing was conducted using the software MestReNova Version 8.1.4 (Mestrelab Research S.L.).The normalized integral values were mean centered for principal component analysis (PCA),partial least squares-discrimination analysis (PLS-DA),and orthogonal projection of latent-structure-discrimination analysis (OPLS-DA) by SIMCA-P+ software package (ver.12.0,Umetrics AB,Umeå,Sweden).Results:NMR spectra of urine samples were dominated by the numerous signals from lactate,creatinine,N-oxide,The metabolites of concentration rising included,butyrate,leucine,isobutyrate,lactate,succinate,hypoxanthine,2-hydroxybutyrate,2-hydroxyisovalerate;The metabolites of concentration declining included pyruvate,glutamine,citrate,formate and glycine.Conclusion:This class presents the characteristics of anaerobic,aerobic and mixed oxygen metabolism,and conforms to the characteristics of modern middle & long-distance race,and achieves the purpose of the training class and gets a effectiveness.The rising of butyrate and isobutyrate after the training may be a key metabolism of aerobic.The declining of creatinine and rising of TMAO may be the key metabolisms of fatigue due to heavy load training.

metabonomic;middle&long-distancerace;heavyloadtraining;exercisefatigue;NMR

1000-677X(2015)07-0048-09

10.16469/j.css.201507006

2014-11-06；

2015-06-29

上海市科学技术委员会资助项目(13490503700)。

马海峰(1970-)，男，安徽宿州人，副教授，博士，硕士研究生导师，主要研究方向为体能训练及中医针灸与运动训练，Tel：(021)51253201，E-mail：mahf1970@sus.edu.cn；吴瑛(1957-)，男，山东蓬莱人，教授，博士，博士研究生导师，E-mail：wuying5766@163.com。

上海体育学院，上海 200438 Shanghai University of Sport,Shanghai 200438,China.

G804.7

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