高效液相凝胶过滤色谱法测定注射用乌司他丁中乌司他丁的含量*

甘惠贞，林淑瑜，潘丹婷，杨昌云

(解放军第180医院药学科，泉州 362000)

高效液相凝胶过滤色谱法测定注射用乌司他丁中乌司他丁的含量*

甘惠贞，林淑瑜，潘丹婷，杨昌云

(解放军第180医院药学科，泉州 362000)

目的 建立高效液相凝胶过滤色谱法测定注射用乌司他丁中乌司他丁的含量。方法 色谱柱：凝胶柱TSKgel G3000SWxl(7.8 mm×300 mm，5 μm)；流动相：[0.001 mol·L-1磷酸二氢钠-0.001 mol·L-1磷酸氢二钠(39：61)]-乙腈(90：10)；流速0.7 mL·min-1；检测波长280 nm；柱温25 ℃；进样量20 μL。结果 乌司他丁的检测质量浓度线性范围为0.781 25～50.00 U(r=0.999 9)；低、中、高剂量样品平均回收率分别为100.32%，100.17%，100.21%，RSD分别为0.633%，0.568%，0.414%(n=3)。结论 该法简便、快速，结果准确，可用于乌司他丁的含量测定。

乌司他丁；含量测定；色谱法，凝胶过滤，高效液相

乌司他丁是肝脏分泌的一种具有广谱蛋白酶抑制作用的糖蛋白，属于人体内源性抗炎物质，能够抑制胰蛋白酶、α-糜蛋白酶和粒细胞弹性蛋白酶等多种蛋白水解酶的活性，促进酶的降解[1]。注射用乌司他丁是从新鲜人尿中分离纯化的尿胰蛋白酶抑制药，为糖蛋白，含有143个氨基酸，相对分子质量约67 000，是一种典型的Kuniz型的蛋白酶抑制药[2]，目前临床上广泛应用于急慢性胰腺炎，各种休克及各种大手术时的脏器功能保护。注射用乌司他丁在水溶液中稳定性差，为了确保药品的质量，采用高效液相凝胶过滤色谱法，测定注射用乌司他丁中乌司他丁的含量。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Ultimate3000高效液相色谱仪(戴安中国有限公司)，JA2003电子分析天平(上海方瑞仪器有限公司，感量：1 mg)，PHS-3C型实验室pH计(上海诚宁环保科技有限公司)，注射器，移液枪。

1.2 试药 乌司他丁标准品(中国食品药品检定研究院，批号：140785-201001)，注射用乌司他丁(广东天普生化医药股份有限公司，规格：每瓶10万U，批号：031304023，031308014，031309113)，乙腈(美国Fisher公司，色谱纯)，磷酸二氢钠(美国MREDA，色谱纯)，磷酸氢二钠(美国MREDA，色谱纯)，水为超纯化水(本院消毒供应室提供)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：TSKgel G3000SWxl(7.8 mm×300 mm，5 μm)；流动相：[0.001 mol·L-1磷酸二氢钠-0.001 mol·L-1磷酸氢二钠(39：61)]-乙腈(90：10)；流速0.7 mL·min-1；柱温25 ℃；检测波长280 nm；进样量20 μL。注射用乌司他丁的辅料为甘露醇、氯化钠、磷酸缓冲溶液，在该色谱条件，辅料无吸收峰，不会干扰注射用乌司他丁的含量测定。

2.2 溶液的制备

2.2.1 标准品溶液的制备 取乌司他丁标准品1瓶(100 000 U)，置10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，避光、室温下保存。

2.2.2 供试品溶液的制备 模拟临床使用方法实际常用浓度配制，取注射用乌司他丁1瓶(100 000 U)加入10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，作为母液。再取母液2 mL置100 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，得浓度为200 U·mL-1的供试品溶液。

2.3 专属性实验 ①酸破坏：按照标准品溶液制备方法制备200 U·mL-1乌司他丁标准品溶液，加盐酸调pH<2，放置4 h后，用氢氧化钠溶液调pH至中性。②碱破坏：加氢氧化钠溶液调pH>10，放置4 h后，用盐酸调pH至中性。③光照破坏：强光(4 500 lx)照射4 h。④加热破坏：37 ℃水浴加热4 h后，冷却。分别将以上破坏后的标准品溶液按“2.1”项下色谱条件进样测定。破坏实验结果见图1。本品经酸、碱破坏后与标准品谱图比较，都有明显的降解产物生成，所产生的杂质与乌司他丁分离度良好；光照、加热破坏实验无新的物质生成。因此通过专属性实验可得出乌司他丁对酸、碱不稳定。

2.4 线性关系考察 分别精密吸取一定量乌司他丁标准品溶液，稀释制成浓度分别为39.06，78.12，156.25，312.50，625.00，1 250.00，2 500.00 U·mL-1的溶液。在色谱条件下，分别进样20 μL。以标准品质量U(X)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，进行线性回归，得标准曲线方程A=0.253 2X-0.001 7，r=0.999 9，结果表明乌司他丁在0.781 25～50.00 U范围内与其峰面积有良好的线性关系。

2.5 精密度实验 制备高、中、低浓度的乌司他丁标准品溶液(1 250，625，312.5 U·mL-1)各3份，同日测定并连续测定5 d，计算峰面积，得高、中、低浓度的日内精密度RSD分别为0.83%，0.61%，0.46%；日间精密度RSD分别为0.63%，0.70%，0.59%，结果表明精密度良好。

2.6 重复性实验 取同一批(批号：031304023)样品，按照“2.2.2”供试液制备方法制备200 U·mL-1乌司他丁供试品溶液6份，进样，测得峰面积 RSD=0.51%，结果表明重复性良好。

2.7 加样回收率实验 取已知含量的注射用乌司他丁(批号：031304023)，精密称定，加溶剂溶解制成乌司他丁含量为 200 U·mL-1的溶液，分成 3 组，分别精密加入3种剂量乌司他丁标准品，制成浓度分别为360，400，440 U·mL-1的样品溶液，取 20 μL进样，各测定3次，取平均值，计算回收率和RSD，结果见表1。

2.8 稳定性实验 取同一份供试液(批号：031304023)，分别于0，2，4，6，8，24 h进样分析，根据乌司他丁的峰面积计算，得RSD为0.18%(n=6)，结果表明稳定性良好。

2.9 供试品含量测定 取3个批号的注射用乌司他丁10万U。每个批号的药品按照供试品溶液的配制方法进行配制成2 00 U·mL-1的溶液，在“2.1”项下色谱条件下进样20 μL测定，分别测定5次。含量测定结果显示(表2)，3个批号样品乌司他丁含量分别相当于标示含量的100.16%，101.04%，100.55%，均达到药品含量的要求。

3 讨论

参考2010年版《中华人民共和国药典》[3]，乌司他丁及有关物质的含量测定方法采用分子排阻色谱法，使用凝胶色谱柱TSKgelG3000SWxl(7.8 mm×300 mm，5 μm)，以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠6.90 g、磷酸氢二钠 17.91 g及氯化钠8.77 g，加水800 mL溶解，调节pH为6.8，加水至1 000 mL)为流动相，流速为0.7 mL·min-1，检测波长为280 nm。理论板数按乌司他丁峰计算不低于800。本品为大分子多肽类糖蛋白，因此需选择适用于分离本品的凝胶色谱柱TSKgelG3000SWxl(7.8 mm×300 mm，5 μm)。参考近年来有关凝胶色谱柱实验的相关文献[4-5]，所使用的磷酸盐浓度均较低，且加入一定量乙腈，在《中华人民共和国药典》测定方法的基础上调整磷酸盐浓度及其与有机溶剂的比例，最终以[0.001 mol·L-1磷酸二氢钠-0.001 mol·L-1磷酸氢二钠(39：61)]-乙腈(90：10)为流动相进行实验。乌司他丁的峰宽从1.439 min下降至0.203 min，柱效从904提高至23 181。凝胶色谱柱所承受的压力不宜过大，流速减小可降低柱压，而流速过小，保留时间过长亦不适宜，兼顾两方面因素，选择0.5，0.7 mL·min-1进行对比实验。结果表明流速选择为0.7 mL·min-1较为适宜。

表2 注射用乌司他丁含量测定结果

本实验建立的方法简便、快速、准确，可用作注射用乌司他丁的含量测定。

[1] 邓志会，李波，肖徽，等.高效液相凝胶过滤色谱法测定沙蚕金属蛋白酶的纯度[J].齐齐哈尔医学院学报，2011，32(21)：3505.

[2] 陈汉明，郑伟钢.乌司他丁对ALI/ARDS患者疗效分析[J].中国社区医师，2013，15(1)：57-58.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京：中国医药科技出版社，2010：64-65.

[4] 褚良，张哲.盐酸头孢替安酯的聚合物检查方法的建立与验证[J].哈尔滨医药，2012，32(3)：171-172.

[5] 王成刚，周立春，王俊秋.高效分子排阻色谱法分析注射用头孢噻吩钠中的高分子杂质[J].中国药品标准，2010，11(5)：340-342.

DOI 10.3870/yydb.2015.06.031

2014-02-12

2014-07-17

*医院基金课题项目(11D3007)

甘惠贞(1973-)，女，福建漳州人，主管药师，学士，研究方向：药房管理。电话：0595-28919451，E-mail：13599220436@139.com。

杨昌云(1973-)，男，江西萍乡人，副主任药师，学士，研究方向：医院药学。电话：0595-28299531，E-mail：yidalsy2005@163.com。

R982；R927.2

B

1004-0781(2015)06-0814-03