ELISA检测孔雀石绿的体会

[摘 要] 作者简述了孔雀石绿的ELISA检测方法、经验及关键环节的注意事项，为实验室检测人员提供参考。[关键词] 孔雀石绿 ELISA检测方法

作者简介：齐海霞（1973－），高级兽医师，从事实验室管理及检测。

1　孔雀石绿概述及危害

孔雀石绿是人工合成的有机化合物，它既是杀真菌剂，又是染料，易溶于水，溶液呈蓝绿色。孔雀石绿进入人类或动物机体后，可以通过生物转化，还原代谢成脂溶性的无色孔雀石绿，具有高毒素、高残留和致癌、致畸、致突变作用，严重威胁人类身体健康。所以，我国于2002年将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中，禁止用于所有食品动物。

2　检测方法

当前，水产品中的孔雀石绿残留检测方法有四种。即快速检测、ELISA检测、高效液相色谱法检测、液相色谱-串联质谱检测法。其中孔雀石绿ELISA检测方法所需物品少且出现结果快，检测成本相对较低，检测结果比较准确，较适用于大多数实验室检测，是最合适的初筛方法。

3　孔雀石绿ELISA检测方法

3.1 样品前处理

（组织样品：鱼、虾样品；稀释倍数：1.5；添加T：0.5ppb）

（1）匀质无骨样品至粉碎均匀（糊状），-20℃保存。

注意：最好提前匀质，因为样品质量较少，加液后匀质会导致损失过多。

（2）准确称取2g匀质好的样品，加入1ml 1x样品提取液A，0.4ml 1x样品提取液B，加入6ml乙腈后，最大速度涡旋振荡4min或者振摇20 min。

注意事项：

A、样品提取液A比较难溶解，需提前配制，且搅拌时间较长。

B、先加样品提取液A、B后涡旋至组织分散，再加入乙腈涡旋。乙腈会让组织抱团，致使组织分散障碍，无法达到混合均匀的目的。

（3）室温（22.5±2.5）℃下转速4000rpm离心10min后，取2 ml上层有机液到另一新离心管中，该离心管中应先加入300mg的纯化试剂，最大速度涡旋振荡1min后，室温（22.5±2.5）℃下静置10min。

注意：需先称量纯化试剂再加上层有机液；确保静置时间，不宜缩短，以免影响实验结果。

（4）室温（22.5±2.5）℃下转速4000rpm离心10min。

（5）取1ml上清液到一干净离心管中，通过平行蒸发或者氮气吹干（50℃～60℃水浴）。

注意：乙腈吹到完全干燥，但不宜时间过久，1ml液体基本吹干需半小时左右，视具体情况而定。

（6）加入100μl 的1x 氧化剂液到吹干的样品管中，涡旋振荡1min后，室温（22.5±2.5）℃下转速4000 rpm离心1min后，室温下静置15min。

注意：氧化剂液配制需用乙腈稀释；离心1min不可省略，静置时间不可缩短。

（7）加入400μl的1x样品提取液C到样品中。

（8）加入650μl的正己烷到样品中，涡旋振荡1min后，室温（22.5±2.5）℃下最大转速离心5min。

注意：最大转速以离心机为准，可用10 000rpm，如无法达到可适当降低转速。

（9）弃除上层有机溶液，每孔取出90μl下清液，即可进行样品检测。

注意：弃除上层有机溶液及杂质的同时，尽量多的保留下清液，以免点板时由于样品液过少而无法做平行。

注：前处理所需仪器为天平、匀质器、离心机、涡旋仪、平行蒸发仪或氮吹仪。

3.2 样品上机

注意事项：检测步骤中所用酶标板、标准品等需提前回温1～2h；超过1个月不使用的试剂盒，需将100xMG-生物素耦合物以及标准品冷冻保存。

（1）分别加入90μl标准品或样品于对应的标准品孔及样品孔中。

注意：标准品及样品均需做平行，以保证检测结果的准确性。

（2）在每孔中加入30μl 1xMG-生物素耦合物，轻敲微孔板边缘混匀1min。

注意事项：1xMG-生物素耦合物按1：99比例配置，且现用现配。

（3）室温（22.5±2.5）℃下避光孵育30min。

（4）洗板：洗板3次，每次应该加入250μl 1x洗液，最后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干。

注意事项：拍干的板不宜有气泡，如有气泡应用干净枪头戳破；拍干板后应马上加入下一步反应的液体，避免板过干，影响检测效果。

（5）每孔加入100μl的1x辣根过氧化物酶标记的链亲和素，室温（22.5±2.5）℃下避光孵育15min。

注意事项：1x辣根过氧化物酶标记的链亲和素按1：99比例配置，且现用现配。

（6）洗板：重复（4）过程一次。

（7）加入100μl TMB底物，轻轻混匀1min，室温（22.5±2.5）℃下避光孵育10～15min.

（8）加入100μl的终止液终止反应，在450nm下读OD值。

虽然孔雀石绿ELLSA检测方法步骤繁多，但是只要注意到这些细节，检测结果还是相对准确的。

4　使用ELISA试剂盒检测的注意事项

（1）检测步骤中所用酶标板、标准品等需提前回温1～2h。

（2）匀质应尽量完全，呈糊状。

（3）需振摇混匀时，如用振荡器混匀，振荡时间相比涡旋仪应适当延长。

（4）离心后吸取上清液时，应注意按照吸取的液量选择合适量程的加样器，避免因加样器不合适而吸取到下层有机液。

如：上清液需要1～4ml时，均使用1ml的加样器，可增加吸取次数，但切勿使用5ml的加样器吸取上清液。

（5）氮气吹干前，应先润洗针头；放入样品开始氮气吹干，

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